In Vivo Imaging di Dauer-specifica neuronale ritocca in C. elegans

Summary

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant ‘dauer’ juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

Abstract

I meccanismi che controllano lo stress-indotta plasticità fenotipica di animali sono spesso complesse e difficili da studiare in vivo. Un classico esempio di plasticità indotta da stress è la fase dauer di C. elegans. Dauers sono uno stadio larvale di sviluppo alternativo formata in condizioni di basse concentrazioni di cibo batterica e alte concentrazioni di un feromone dauer. Dauers visualizzare ampia plasticità evolutiva e comportamentale. Ad esempio, un set di quattro quadranti interno-labiale (IL2Q) neuroni soggetta ad un esteso rimodellamento reversibile durante la formazione dauer. Utilizzando la ben nota voce di percorsi ambientali di regolazione dauer, un metodo precedentemente stabilito per la produzione di greggio dauer feromone da grandi culture nematodi liquido è dimostrata. Con questo metodo, una concentrazione di 50.000 – 75.000 nematodi / ml di coltura liquido è sufficiente a produrre una molto potente greggio dauer feromone. La potenza feromone greggio è determined da un saggio biologico dose-risposta. Infine, sono descritti i metodi utilizzati per in vivo time-lapse imaging dei IL2Qs durante la formazione dauer.

Introduction

Plasticità fenotipica, tra cui plasticità evolutiva e comportamentale, è importante per adattamenti alle condizioni ambientali avverse ed è considerato una forza trainante nell'evoluzione ^1. C. elegans è un organismo modello utilizzato frequentemente per gli studi di sviluppo e neurobiologia. In condizioni ideali, C. elegans si sviluppa attraverso quattro stadi larvali prima di entrare nella fase riproduttiva adulto. Tuttavia, in condizioni di scarsa disponibilità di cibo e di alta densità di popolazione, C. elegans può subire un interruttore di sviluppo e di entrare in una fase di lunga durata e resistente alle sollecitazioni dauer ^2. Dauers mostrano molte differenze morfologiche e comportamentali da non dauers che probabilmente mediano questa resistenza allo stress. Gli stimoli ambientali e percorsi genetici che regolano l'ingresso dauer sono stati ampiamente descritti ^{3, 4, 5, 6, 7.} Tuttavia, i meccanismi molecolari che controllano le singole modifiche fenotipiche che si verificano durante formazione dauer sono meno ben compreso.

L'esame di fenotipi specifici-Dauer richiede la produzione di animali Dauer. Questo può essere realizzato in tre modi: 1) Picking da una cultura affamato di C. elegans, 2) Uso della formazione dauer costitutiva (daf-c) mutanti, 3) induzione della formazione dauer attraverso feromone purificato. E 'relativamente semplice per scegliere dauers da una piastra standard NGM con una C. popolazione elegans che ha esaurito il suo batterica di approvvigionamento alimentare. Nelle nostre mani, una piastra standard NGM originariamente seminato con 50 ml di OP50 Escherichia coli, ha permesso di crescere per 3 giorni e successivamente inoculate con 3 – 4 adulti ermafroditi mantenuta a 25 ° C, si esaurirà la fornitura di cibo entro una settimana e produrre diverse migliaia dauers all'interno di un ulteriore 3 giorni (oltre a numerosi non-dauers affamati). Tuttavia, questo metodo non è soddisfacente per i processi che si verificano durante l'esame muta in dAuer. E 'difficile determinare quale delle diverse migliaia di animali su un piatto tipico Starved stanno entrando in dauer. Inoltre, l'uso di una piastra di fame non offre alcuna possibilità di sincronizzazione. L'uso di mutanti daf-c consente la sincronizzazione e la generazione affidabile di dauers. Tuttavia, non vi è alcuna garanzia che una particolare daf-c mutazione non influirà altri fenotipi specifici-Dauer da solo o in combinazione con altre mutazioni.

La presenza di un feromone dauer stato implicito Cassada e Russell e successivamente dimostrato da Golden e Riddle. Il feromone dauer da allora è stato caratterizzato chimicamente ^{2, 8, 9, 10.} Feromone purificato è costituito da una miscela complessa di ascarosides, che in forme diverse a regolare entrambi i processi comportamentali e di sviluppo ^{9, 11.} L'uso di un estratto di feromone greggio dauer permette di induzione affidabile controllata di dauers sincronizzati in uno sfondo wild-type. </p>

Il sistema nervoso e le cellule gliali associate subiscono rimodellamento durante dauer larva formazione ^{12, 13, 14.} Alcuni di questi cambiamenti sono irreversibili, come ad esempio la ristrutturazione delle cellule gliali durante dauer ^{13, 14.} Tuttavia altri eventi di rimodellamento sono reversibili dopo un ritorno favorevole condizioni ambientali. Ad esempio, una serie di quattro neuroni IL2Q subiscono una rapida e reversibile rimodellamento neuronale durante la formazione dauer tra cui: arborizzazione dei dendriti, un passaggio da singolo dendritiche ai neuroni e assoni multidendritic rimodellamento ^12. I metodi consentono qui per imaging attendibile in vivo di neuroplasticità indotta da stress in un organismo modello. I metodi presentati per la produzione e la sperimentazione di greggio dauer feromone sono precedentemente descritti e compilati da diverse fonti ^{4, 8, 15, 16, 17, 18.}

Protocol

1 Crude Dauer feromone Produzione Grow OP50 E. coli da una singola colonia O / N a 37 ° C sotto agitazione in 100 ml di brodo LB a 200 rpm. NOTA: Questo / cultura O N può essere fatta in anticipo e conservato a 4 ° C. Grow N2 C. elegans il 15-20 Giugno piatti cm Petri con NGM agar (vedi ricetta nella tabella 1), testa di serie con 50 ml di OP50 E. coli fino a quando il batterio è quasi esaurito 19. Fai 5x 250 ml di S supporti (vedi ricetta nella ta…

Representative Results

La produzione di greggio risultati dauer feromoni in un liquido giallo (Figura 1) che è sia caldo e freddo stabile. Aliquote di feromone greggio vengono conservati a -20 ° C indefinitamente senza perdita evidente di attività. In seguito la produzione di feromoni, un unico biotest dose-risposta è sufficiente per una stima approssimativa di potenza. Tuttavia, per la maggior parte degli esperimenti è necessario ripetere il saggio biologico 2 – 3 volte e prendere una media di ciascun esperimento. I ris…

Discussion

Un esame della neuroplasticità specifici per dauer e altri cambiamenti morfologici Dauer-associata richiede controllata e affidabile di formazione dauers sia attraverso la mutazione genetica (cioè mutanti, DAF-C) o in caso di esposizione di wild-type animali a feromone. Mentre l'uso di una mutazione genetica per indurre dauers è conveniente, può confondere risultati. Pertanto, i dati raccolti con mutazioni daf-c devono essere successivamente confermati con wild-type animali indotti ad entrare n…

Materials

N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 mL H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 mL of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 mL of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 1 M MgSO4
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 mL. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 mL of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 mL, autoclaved), 2.5 mL of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 liter. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 mL of 1 M CaCl2, and 0.75 mL of 1 M MgSO4.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 mL of 0.513 M NaCl and 5 µL of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 mL culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 mL.  Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µL 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µL 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.  Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving