CのDauer固有の神経リモデリングのin vivoイメージングエレガンス

Summary

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant ‘dauer’ juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

Abstract

動物でストレス誘発表現型の可塑性を制御するメカニズムは、生体内で勉強することがしばしば複雑で困難である。ストレス誘発性可塑性の典型的な例はCのdauer段階である虫 。 Dauers、細菌食品やdauerフェロモン高濃度、低濃度の条件下で形成された代替案の発達幼虫期である。 Dauersは、広範な発達や行動の可塑性を表示します。例えば、4つの内側陰唇象限（IL2Q）ニューロンのセットはdauer形成中に豊富な可逆的リモデリングを受ける。 dauerエントリを調節するよく知られた環境の経路を利用して、大量の液体線虫培養物からの粗dauerフェロモンの製造のための以前に確立された方法が示されている。この方法では、50,000濃度 – 液体培養の線虫75,000 / mlを非常に強力な粗dauerフェロモンを生成するのに十分である。原油フェロモン効力はDETEです用量反応バイオアッセイによりrmined。最後に、dauer形成中IL2Qs のin vivoタイムラプスイメージングのために使用される方法が記載されている。

Introduction

発達や行動の可塑性を含む表現型の可塑性は、不利な環境条件に適応するために重要であると進化¹の原動力であると考えられる。C.虫が頻繁に開発·神経生物学における研究のために使用されるモデル生物である。理想的な条件下で、C.エレガンスは、成人の生殖段階に入る前に4幼虫の段階を経て開発しています。しかし、低食品の可用性と高い人口密度、Cの条件の下でエレガンスは、発達スイッチを受け、長い寿命とストレス耐性のdauerステージ²に入ることができる。 Dauersはおそらく、このストレス耐性を媒介する非dauersからのいくつかの形態学的および行動の相違を示す。 dauerエントリを規制する環境的合図と遺伝的経路は広範囲に^{3、4、5、6、7}について説明したが、分子機構をdを発生する個別の表現型の変化を制御するuringのdauer形成はあまりよく理解されている。

dauer固有の表現型の検査はdauer動物の生産を必要とします。これは、3つの方法で達成することができる。1）Cの飢えた培養物からピッキング虫 、dauer形成構成的（DAF-c）の変異体の2）を使用し、精製されたフェロモンを通じてdauer形成の3）誘導。これは、Cと標準のNGMプレートからdauersを選ぶことは比較的簡単であるその細菌の食料供給を使い果たした虫個体群。私達の手の中に、標準的なNGMプレートがもともと3日間成長させ、その後3を接種したOP50 大腸菌 50μlを、を播種4 -成体雌雄同体は、一週間以内に食糧供給を排気して数千を生成し、25℃に保っさらに3日以内にdauers（多数の飢餓状態の非dauersに加えて）。しかし、この方法は、dの中に脱皮中に発生するプロセスを調べるため不十分であるアウアー。これは、典型的な飢餓プレート上の動物はdauerに入力している数千のかを判断することは困難である。さらに、飢餓状態のプレートの使用は、同期のための可能性を提供していません。 DAF-cの変異体の使用は、同期とdauersの信頼性の高い生成を可能にする。しかし、特定のDAF-C変異は、単独で、またはさらなる変異と組み合わせて他のdauer固有の表現型に影響を与えないという保証はありません。

dauerフェロモンの存在が最初Cassadaとラッセルによって暗黙以降ゴールデンとリドルによって実証された。フェロモンは、以来、化学的に^{2、図8、図9、図10に}特徴付けられている。精製されたフェロモンは異なる形で両方の行動や発達過程^9を規制ascarosidesの複雑なブレンド^、11で構成されています。使用した粗dauerフェロモン抽出物dauerを可能にする野生型のバックグラウンドで同期されたdauersの信頼性が制御さ誘導。 </P>

神経系および関連するグリア細胞がdauer幼虫形成が^12、13、14時のリモデリングを受けています。これらの変更のいくつかは、そのようなdauer ^13、14時のグリア細胞のリモデリングとして、不可逆的であるが、他のリモデリング事象が良好に戻った際に可逆的である環境条件。デンドライト樹枝状分岐、multidendriticニューロンと軸索リモデリング^〜12の単一樹状からスイッチ：たとえば、4 IL2Qニューロンの集合が含むdauer形成時の迅速かつ可逆的神経細胞リモデリングを受ける。本明細書の方法は、モデル生物におけるストレス誘発神経可塑性の信頼性のin vivoイメージングを可能にします。生産、粗dauerフェロモンの試験のために提示される方法は、以前にいくつかの情報源^{4、8、15、16、17、18}から説明され、コンパイルされている。

Protocol

1原油Dauerフェロモン生産 OP50 E.を育てる200rpmでLBブロス100mLに振とうしながら37℃でシングルコロニーO / Nから大腸菌 。注：このO / N培養物を、事前に作製し、4℃で保存することができる。 N2 C.を育てる虫について15から20 OP50 E.を50μlを接種したNGM寒天（表1のレシピを参照してください）と6センチメートルペトリ皿大腸菌は菌までほとん?…

Representative Results

暑さと寒さに安定でもある黄色の液体中の粗dauerフェロモン結果（ 図1）の産生。原油フェロモンのアリコートの活性の明らかな損失で無期限に-20℃で保存されている。フェロモンの生産に続き、単用量反応バイオアッセイは、効力を概算するのに十分である。 3回、各実験からの平均を取る – しかし、ほとんどの実験のためにはバイオアッセイ2を繰り返す必要がある。 2フェロ?…

Discussion

dauer特有の神経可塑性およびその他のdauer関連形態学的変化を調べたところ、遺伝子変異（ すなわち、DAF-C変異体）を介して、またはフェロモンに野生型動物の曝露のいずれかによってdauersの制御された、信頼性の高い形成する必要がある。 dauersを誘導する遺伝子変異の使用が便利であるが、それは、結果を混乱させることがある。したがってDAF-cの変異を有する収集されたデ?…

Materials

N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 mL H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 mL of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 mL of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 1 M MgSO4
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 mL. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 mL of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 mL, autoclaved), 2.5 mL of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 liter. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 mL of 1 M CaCl2, and 0.75 mL of 1 M MgSO4.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 mL of 0.513 M NaCl and 5 µL of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 mL culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 mL.  Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µL 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µL 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.  Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving