C.에서 영속 특정 신경 세포 리모델링의 생체 내 이미징에서 엘레

Summary

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant ‘dauer’ juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

Abstract

동물의 스트레스에 의한 표현형의 가소성을 조절 메커니즘은 생체 내에서 공부를 자주 복잡하고 어렵습니다. 스트레스에 의한 소성의 전형적인 예는 C의 영속 무대 엘레 간스. Dauers 박테리아 음식과 영속 페로몬의 높은 농도의 낮은 농도의 조건에서 형성된 대안 발달 애벌레 단계이다. Dauers 광범위한 발달 및 행동 가소성을 표시합니다. 예를 들어, 네 개의 내부 – 순측 사분면의 세트 (IL2Q) 뉴런 영속 형성 동안 광범위한 가역 리모델링을 겪는다. 대형 선충 액체 배양에서 원유 영속 페로몬의 생산을위한 잘 알려진 경로 환경을 미치는 영속 항목, 이전에 설정된 방법을 활용하는 것이 입증된다. 이 방법으로, 50000의 농도 – 배양액 75000 선충 / ㎖가 고도로 강력한 원유 영속 페로몬을 생산하기에 충분하다. 조 페로몬의 효능 dete입니다용량 반응 생물 검정법에 의해 rmined. 마지막으로, 영속 형성하는 동안 IL2Qs의 생체 시간 경과 영상에 사용되는 방법이 설명되어 있습니다.

Introduction

발달 및 행동 가소성을 포함 표현형 소성은 불리한 환경 조건에 적응하기위한 중요하고 진화 ^한 원동력으로 간주됩니다. C. 엘레 자주 개발 및 신경 생물학의 연구에 사용되는 모델 생물이다. 이상적인 조건에서, C. 엘레 성인 생식 단계에 들어가기 전에 사 애벌레 단계를 통해 개발하고 있습니다. 그러나, 낮은 음식 가용성과 높은 인구 밀도, C의 조건에서 엘레 발달 스위치를 받아야하고 수명이 긴 스트레스에 강한 영속 ² 단계로 입력 할 수 있습니다. Dauers 가능성이 스트레스 저항을 중재 비 dauers에서 여러 형태 학적 및 행동의 차이를 표시합니다. 영속 항목을 규제하는 환경 단서 및 유전 적 경로가 ^{광범위하고, 5, 4, 3 6, 7을} 설명했다. 그러나, 각각의 표현형의 변화를 제어하는 분자 메커니즘을 거라고 발생하는uring의 영속 형성이 덜 잘 이해된다.

영속 특정 표현형 검사는 영속 동물의 생산을 필요로한다. 이 세 가지 방법으로 수행 할 수 있습니다 : 1) C의 결핍 문화 따기 엘레 간스, 2) 영속 형성 제정 (DAF-C) 돌연변이, 정제 페로몬을 통해 영속 형성 3) 유도의 사용. 그것은 C.있는 표준 NGM 플레이트에서 dauers을 선택하는 비교적 간단하다 그 박테리아의 식품 공급을 소진했다 elegans의 인구. 우리의 손으로, 표준 NGM 플레이트는 원래 삼일 성장이 허용 이후 3 접종 OP50 대장균의 50 μL, 시드 – 4 성인 자웅 동체는 일주 내에서 식량 공급을 배출하고 수천을 생산합니다 25 ° C로 유지 추가 3 일 이내 dauers (공복 수많은 비 dauers 이외에). 그러나,이 방법은 D로 탈피 중에 발생하는 검사 공정에 불만족AUER. 그것은 영속에 입력하는 일반적인 굶주린 접시에 수천의 동물을 결정하기가 어렵습니다. 또한, 고갈 플레이트의 사용은 동기화를위한 가능성을 제공하지 않는다. DAF-C 돌연변이 체의 사용은 동기화 및 dauers의 안정적인 생성을 허용한다. 그러나, 특정 DAF-C 돌연변이가 단독으로 또는 추가 돌연변이와 함께 다른 영속 특정 표현형에 영향을 미치지 않는다는 보장은 없습니다.

영속 페로몬의 존재는 첫째 Cassada 러셀에 의해 암시하고 나중에 황금과 수수께끼에 의해 입증되었다. 영속 페로몬은 이후 ^{화학적, 열 9, 8,이} 특징으로하고있다. 정제 된 페로몬은 다른 형태로 ^9, 원유 영속 페로몬 추출물 ^11. 사용이 가능 모두 행동 및 발달 과정을 조절 ascarosides의 복잡한 혼합으로 구성 야생형 백그라운드에서 동기화 dauers의 안정적인 제어 유도. </p>

신경계 및 관련 아교 세포는 영속 유충 형성 ^{12, 13, 14시} 개장을받을. 이러한 변화 중 일부는 영속 ^{13 일 14시} 신경교 세포의 리모델링으로 되돌릴 수 있습니다. 그러나 다른 리모델링 이벤트가 유리한에 반환시 되돌릴 수 있습니다 환경 조건에 따른 것입니다. 수상 돌기 arborization, multidendritic 신경 세포와 축삭이 ^{12 개조에} 하나의 돌기에서 스위치 : 예를 들어, 네 IL2Q 뉴런의 집합을 포함 영속 형성하는 동안 신속하고 가역적 신경 리모델링을 거쳐. 방법은 여기에 모델 생물 스트레스에 의한 신경 가소성의 신뢰할 수있는 생체 내 이미징 할 수 있습니다. 원유 생산 및 영속 페로몬의 테스트를 위해 제시된 방법은 앞서 여러 소스 ^{4, 8, 15, 16, 17, 18에서} 설명한 컴파일된다.

Protocol

1 원유 영속 페로몬 생산 OP50 E. 성장 하나의 식민지 O에서 / N 37 ° C에서 대장균은 200 rpm에서 LB 배지 100 ㎖에 떨고있다. 참고 :이 O / N 문화가 사전에 4 ° C에 저장할 수 있습니다. N2 C. 성장 엘레 15 – 20 OP50 E.의 50 μL 시드 NGM 한천 (표 1의 레시피 참조) 6cm 배양 접시 대장균 박테리아까지 거의 19 고갈된다. 1 L 삼각에 S 미디어의 5 배 250 ㎖?…

Representative Results

더위와 추위 안정적인있는 노란색 액체의 원유 영속 페로몬 결과 (그림 1)의 생산. 원유 페로몬 일정량 활동의 명백한 손실 무기한 -20 ° C에 저장됩니다. 페로몬의 제조에 이어, 단일 용량 – 반응 생물 검정법의 효능은 대략적으로 충분하다. 3 회, 각 실험으로부터 평균을 취 – 그러나, 대부분의 실험에는 생물 검정 2를 반복 할 필요가있다. 이 페로몬 생물 검정에서 대표 결과는 그…

Discussion

영속 별 신경 가소성 및 기타 영속 관련 형태 학적 변화를 검사 통제되고 하나 유전자 변이 (즉, DAF-C 돌연변이)를 통해 또는 페로몬 야생 형 동물의 노출에 의해 dauers의 안정적인 형성이 필요합니다. dauers를 유도하는 유전자 변이의 사용이 편리하지만, 그 결과를 혼란시킬 수있다. 따라서 DAF-C 돌연변이로 수집 된 데이터는 이후 영속 페로몬에 노출 영속 단계를 입력하도록 유도 야생?…

Materials

N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 mL H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 mL of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 mL of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 1 M MgSO4
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 mL. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 mL of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 mL, autoclaved), 2.5 mL of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 liter. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 mL of 1 M CaCl2, and 0.75 mL of 1 M MgSO4.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 mL of 0.513 M NaCl and 5 µL of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 mL culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 mL.  Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µL 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µL 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.  Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving