Kütle spektrometresi ile In-jel Geliştirilmiş İndirgemeli β-Eleme Kapsamlı O-bağlı ve için Sulfo-Glikomik
Summary
In order to comprehensively explore the diversity of O-linked glycans, a new procedure for in-gel reductive β-elimination, combined with permethylation and a rapid phase-partition method, is applied to the analysis of O-linked glycans directly released from glycoproteins resolved by SDS-PAGE and amenable to subsequent glycomic analysis by mass spectrometry.
Abstract
Separation of proteins by SDS-PAGE followed by in-gel proteolytic digestion of resolved protein bands has produced high-resolution proteomic analysis of biological samples. Similar approaches, that would allow in-depth analysis of the glycans carried by glycoproteins resolved by SDS-PAGE, require special considerations in order to maximize recovery and sensitivity when using mass spectrometry (MS) as the detection method. A major hurdle to be overcome in achieving high-quality data is the removal of gel-derived contaminants that interfere with MS analysis. The sample workflow presented here is robust, efficient, and eliminates the need for in-line HPLC clean-up prior to MS. Gel pieces containing target proteins are washed in acetonitrile, water, and ethyl acetate to remove contaminants, including polymeric acrylamide fragments. O-linked glycans are released from target proteins by in-gel reductive β-elimination and recovered through robust, simple clean-up procedures. An advantage of this workflow is that it improves sensitivity for detecting and characterizing sulfated glycans. These procedures produce an efficient separation of sulfated permethylated glycans from non-sulfated (sialylated and neutral) permethylated glycans by a rapid phase-partition prior to MS analysis, and thereby enhance glycomic and sulfoglycomic analyses of glycoproteins resolved by SDS-PAGE.
Introduction
Glikosilasyon organizma fizyoloji, doku patolojisi ve hücre tanıma 1-3 katkıda bir esas teşkil eden protein translasyon sonrası değişiklik. Analitik Glycoscience büyük ilerlemelere rağmen, belirli bir protein glıkanların tam çeşitliliği tanımlamak özellikle temel biyolojik kaynaklardan izole edilmiş protein ile ilgili olarak, son derece zorlu bir iştir. Bununla birlikte, glikoprotein glıkanların mikroheterojenlik sıklıkla diğer proteinler ile fonksiyonel etkileşimlerin etkiler. Bu nedenle, glıkan çeşitlilik karakterizasyonu hücre ve doku glikosilasyon 4,5 'fizyolojik önemini anlamak için gereklidir. Doku fizyoloji ve patofizyoloji, sağlam, hassas ve kapsamlı glycomic analitik teknikleri glikoprotein glycosylation'nin katkılarını anlamak için giderek daha önemli hale gelmiştir. Proteomik analizde, protein, teşhisi genellikle LC-MS ile elde edilir/ Triptik peptitler 6 MS analizi. Protein sindirimi gibi 7-9, tripsin gibi proteazlar ile jel yumuşatıldıktan sonra, SDS-PAGE ile yeniden çözülmüş saflaştırılmış bir protein ya da proteinleri kullanılarak gerçekleştirilebilir. SDS-PAGE ile protein karışımı Önzenginleştirme proteini numarası derinliğini ve doğruluğunu arttırır. Glikoprotein Glikosillenmenin glycomic analizi için benzer stratejilerin geliştirilmesi Glycoscience ön planda yer alır.
Glıkanların iki ana sınıfı, N-bağ ya da O-bağlantısı yoluyla ya proteini omurgalarına bağlanır. N-bağlantılı glikanları asparagin bağlıdırlar (Asn), Asn-X-Ser / Thr / Cys olarak tanımlanan bir sequon kapsamında bulunan tortular (X, prolin dışında herhangi bir amino asittir) ve peptit N ile enzimatik sindirme ile serbest bırakılabilir -glycanase (PNGaseF veya A), ya da çözelti içinde,-jel ya da açık-blot 10-12. O-bağlantılı glıkanlar, esas olarak serin (Ser) veya treonin (Thr) kalıntılarına eklenir. Ancak, sadece bir enzim iden edilmiştirglikoproteinin, O-bağlantılı glikanları salabilen ve sadece basit O-bağlantılı glikanlar salan, son derece sınırlı bir glıkan özgüllüğe sahiptir giderilene. Chemical Release stratejileri glikoproteinlerden O-bağlantılı glıkanların kapsamlı serbest bırakılması için tercih edilen bir yöntem olmaya devam etmektedir. Indirgeyici ya da indirgeyici olmayan β-kaldırılması veya hidrazinolize İyi karakterize edilmiş kimyasal tahliye etme teknikleri ve glikoproteinlerin 13,14, O-bağlantılı glikanları salınması için en yaygın olarak kullanılan tedavi alanında bulunmaktadır. İndirgeyici β-eliminasyon, SDS-PAGE ile ayrılmış glikoproteinlerden O-bağlantılı glikanlar serbest bırakmak için kullanılmış olmasına rağmen, daha önceki yaklaşımlar sonraki analiz 15-17 HPLC ayırma gereklidir.
Çok Boyutlu MS (MS n) analizi şu anda en çok biyolojik kaynaklardan beklenen miktarlarda izole glikoproteinlerden serbest glikanları karakterize yapısal verilerin zengin kaynağı sağlar. MS derinliğimerkezli bir yapısal karakterizasyon büyük ölçüde önce analizleri için salınan glikanlar permethylating ile kolaylaştırılır. Permethylation iyonizasyon artırır ve glıkan yapıları 18,19 geniş bir aralığı boyunca mol sinyal tepkilerinin eşitlemeye çalışır. Buna ek olarak, permethylation açıkça böylece yapısal açıklanmasını 20-23 arttırıcı özgü kitleler terminal ve yer değiştirmiş monosakkarit kısımları, etiketler. Örneğin, asidik glıkanlar MS non-permetilatlı türler olarak tespit etmek için, genellikle zordur. Asidik glıkanlar MS ile de negatif iyon modunda tespit edilebilir, ancak, aynı iyon modunda hem asidik hem de nötr glikanların, tespit etmek mümkün değildir. Glıkan permethylation önemli bir avantajı, permetilatlı bir glıkan en monosakarit ikame üzerindeki serbest hidroksil gruplarının (OH) her bunları tespit yapmak, bir metil grubu (OCH3 ya da OMe), bu şekilde sialilatlı bir glıkan ücretlerini nötrleştirilir başlıklı hale olmasıdır nötr (asyalo) glıkanlar. Bununla birlikte, sulfoglycans sülfatlanmıştır kısımların hidroksil iyonizasyonunu ve hassasiyetini azaltır anyonik şarj, retansiyonu ile sonuçlanır permethylation dayanıklıdır. Bu bastırma anda sülfatlı glikanların 24-26 yüksek bir bereket taşımak gibi müsinlerin gibi çok karmaşık glikoproteinler, kapsamlı glycomic analizini önler.
Arındırıcı sülfatlı Glikanların dair son raporlar ters-faz saflaştırmak için kromatografi ve MALDI analizden önce ayrı permetilatlı glikanlar, ücret kullanılmıştır. Bu yöntem, organik faz bölümleme daha az kesin olarak bulduk, elüsyon için farklı mobil fazlar kullanılarak sülfatlı ve sülfatlı olmayan glıkanların tamamen ayrılmasına dayanır. Bu nedenle, sulfoglycans saptanması ve zenginleştirilmesi için uygun olan yeni bir teknik burada sunulmuştur. Bu teknikler, su ardından sulu faz içinde sülfatlanmış glıkanların kantitatif iyileşme sağlar: DCM (diklorometan)rutin glıkan permethylation reaksiyonlar 27 sonunda gerçekleştirilir ekstraksiyon. Ayrıca, MS 2 parçalanma desen basitleştirirken Önemli olarak, permetilatlı sülfatlanmamış glıkanların karışımından permetilatlı sulfoglycans bu sağlam ayrılması eş zamanlı olarak yüklü türler için zenginleştirir. Geliştirilmiş-jel O-bağlantılı glıkan analizi için kapsamlı bir protokol de sunulmuştur. Geliştirilmiş protokol, glıkan iyileşmeye katkıda MS ile elde edilebilen N permetilatlı glikanların analiz yapısal bilgi arttırır, ve biyolojik kaynaklardan izole edilmiş temel glikoproteinlerine uygulanan sulfoglycomic analiz duyarlılığını arttırır.
Bu protokol, tüm glikoprotein özleri O-bağlantılı glıkan analizi ya da SDS-PAGE ile çözülmüş, ilgilenilen belirli bir glikoproteini amaçlanmıştır üç deney prosedürleri oluşmaktadır; A) jel temizlik, B) jel indirgeyici β-eliminasyon, ve C) glukanıdır permethylation. Amaç, biyolojik açıdan ilgi (Şekil 1), başlıca kaynaklarından hasat glikoproteinler için kapsamlı bir O-bağlantılı glycomic verileri elde etmektir. SDS-PAGE ile ayrılmış Glikoproteinler boyama ve ilgili bantlar kesilir ve elde edilen jel bant küçük parçalar halinde dilimlenir tarafından görüntülenmiştir. Jel parçaları boyası ve jel kirletici maddelerin (Şekil 2A) ortadan kaldırılması için etil asetat yıkamaya tabi tutulur. Glikan serbest-jel indirgeyici β-eliminasyon (Şekil 2B) ile elde edilir ve salınan glikanlar permetilatlı edilir. Sulu organik ekstraksiyon takip permethylation kantitatif uzaklıkta, sülfatlı olmayan nötr glikanların (Şekil 2C) için anyonik sülfatlanmış glikanları böler. -Jel sulu-organik ekstre bağlanmış indirgeyici β-eliminasyon, SDS-PAGE ile ayrılmış glikoproteinin küçük miktarlarda serbest O-bağlantılı glıkanların ve sulfoglycans karakterizasyonu sağlar. Stratejik bakış hülâsa olduğunuŞekil 1 ve ayrıntılarda kanşımının, Şekil 2'de gösterilmiştir. Buna ek olarak, boyası ile yıkandı, jel parçalarının bir kısmı, standart bir LC-MS / MS teknikleri proteomik protein numarası için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Combining in-gel reductive β-elimination with aqueous-organic extraction enhances the sensitivity and depth of structural data that can be acquired for characterizing sulfated and non-sulfated O-linked glycans harvested from small amounts of mucin-type glycoproteins resolved from other proteins by SDS-PAGE. The essential advances of the technical approaches presented in this study are: (a) facile removal of gel derived contaminants by simple washing steps; (b) quantitative recovery of permethylated sulfoglycans in t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the grant P01HL107151 from the NHLBI/NIH. The authors also gratefully acknowledge the support and access to instrumentation provided through grant P41GM103490 from the NIGMS/NIH.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Water, deionized water | Sigma-Aldrich | 270733-4L | CHROMASOLV, for HPLC |
| Acetic acid, Glacial | Fisher | A38-500 | Certified ACS≥99.7 w/w % |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9% |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830-500G | BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1 |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1 |
| Ethyl acetate | Fluka | 34972-1L-R | LC-MS CHROMASOLV, Step 1 |
| Sodium borohydride | Aldrich | 213462-25G | ReagentPlus, 99%, Step 2 |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | ReagentPlus, 99.5%, Step 6. Store at 4 °C until use. Sit at room temperature before use. |
| Sodium hydroxide solution, 50% w/w | Fisher | SS254-1 | Certified, Step 6 |
| Dimethyl sulfoxide, anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855-1L | Anhydrous, ≥99.9%, Step 6 |
| Methanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | Anhydrous, 99.8%, Step 6 |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-4L | CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7 |
| Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh | Sigma-Aldrich | 217506-500G | Step 3 |
| AG 50W-X8 Resin | Bio-Rad | 142-1441 | Step 3 |
| BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase | JT Baker | JT-7020-01 | Step 5 and 8 |
| 7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | Step 1 | |
| Bio-Safe Coomassie Stain | Bio-Rad | 161-0786 | G-250, Step 1 |
| Silver Stain Kit for Mass Spectrometry | Pierce | 24600 | Step 1 |
| Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) | Supelco | 47265 | |
| Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) | Supelco | 47265 | |
| Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip | VWR | 14673-010 | Wash before use |
| PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-13 | Wash before use |
| PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-16 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-13 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-15 | Wash before use |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81265 | volume 500 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81165 | volume 250 μL, needle size 22 ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81065 | volume 100 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 80965 | volume 50 μL, needle size 22s ga |
| Hamilton Calibrated Syringes | HAMILTON | 80300 | volume 10 μL, needle size 26s ga |
| Petri Dish Glass 100mm x 15mm | GSC INTERNATIONAL INC | 1500-4 | Wash before use, Step 1 |
| Bard-Parker Surgical Blades | Fisher | 371310 | Step 1 |
| Reacti-Therm Heating/Stirring Module | Pierce | 18870 | Step 1, 4 and 7 |
| Heating Blocks | Fisher | 125D | Step 2 |
| Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm | Aldrich | CLS3950 | Step 3 |
| Fused Silica CutterTubing cutter | alltech | 3194 | Step 3 |
| Multi-tube vortexers | VWR | 444-7063 | Step 6 |
| Lyophilizer 25EL Freezemobile | Virtis | 25EL | |
| Centrifuge | VWR | Clinical 50 | |
| LTQ Orbitrap Discovery | Thermo Fisher Scientific | 0 |
References
- Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
- Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
- Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
- Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
- Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280 (5), 3121-3124 (2005).
- Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3 (3), 280-286 (2004).
- Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203 (1), 173-179 (1992).
- Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an ‘In-Gel’ digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224 (1), 451-455 (1995).
- Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6 (14), 3993-4015 (2006).
- Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17 (5), 925-931 (1996).
- Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250 (1), 82-101 (1997).
- Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).
- Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).
- Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).
- Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).
- Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).
- Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).
- Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
- Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).
- Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).
- Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
- Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).
- Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).
- Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).
- Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).
- Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).
- Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).
