串联高压冷冻和植物组织中快速冷冻替代透射电子显微镜
Summary
Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.
Abstract
自从20世纪40年代的透射电子显微镜（TEM）一直提供生物学家与生物材料的超高分辨率图像。然而，因为费力和费时的协议也需要经验中制备无伪影的样品的，TEM不被认为是用户友好的技术。对于传统的TEM样品制备中使用的化学固定剂保存细胞结构。高压冷冻是生物样品在高压下的冷冻固定，以产生非常快的冷却速率，从而限制了冰的形成，这是不利于细胞的超微结构的完整性。高压冷冻和冷冻替代目前所选择的用于制造高质量的形态在用于TEM树脂部分中的方法。这些方法最大限度地减少通常与传统的加工相关的超薄切片透射电镜的文物。冷冻固定后的冷冻水的样品中被替换为液体在低温条件下的有机溶剂中，这个过程被称为冷冻替代。冷冻替代典型的是在上专用的，昂贵的设备数天。最近的创新允许而不是通常的两天过程在三小时内完成。这之后通常是样品制备，包括浸润和切片之前在环氧树脂包埋的几天。在这里，我们提出了一个协议，结合高压冷冻和速冻置换，使植物样品固定待小时内完成。该协议可以很容易地适于与其他组织或生物体的工作。植物组织是因为加气空间和装满水的空泡阻碍水无冰冷冻的存在，特别令人关注。此外，化学固定的方法是在由于细胞壁阻碍的化学品渗透至深处的组织内的植物特别长。植物组织，因此particularly具有挑战性的，但这个协议是可靠的，并产生最高质量的样品。
Introduction
我们的细胞超微结构的知识主要来源于电子显微镜，它可以在几纳米1的范围内解决的细节。尽管是如此强大，在透射电子显微镜的分辨率不考虑人性化，样品制备，需要费时费力的协议，并从医生需要一定的专业知识。样品的传统固定结合了使用的醛和四氧化锇在进一步处理之前，包括脱水，在树脂包埋，然后切片，以产生超薄切片被，然后用重金属染色。然而，已知的是化学固定可产生伪影，包括蛋白质聚集和脂质1的损失，并以膜，最终影响多种细胞区室2的变化。这些构件在很大程度上归因于固定和脱水的缓慢速率在 室温下3，4，5。
<p class="“jove_content”">冷冻固定高压冷冻（HPF），避免了最引起化学固定的文物。冷冻固定的原则是，它降低了水的凝固点以20度时，会减慢冰晶体的成核和生长，并增加水的粘度在生物样品中，使细胞成分基本上是固定的6,7。HPF减小Ä样品的温度至该液态氮的，非常高的压力（210兆帕或2100巴）的以毫秒为单位下。如果处理得当HPF防止形成大的冰晶，能导致细胞超微结构的重大伤害。 HPF可用于固定的100-200微米厚的样品在生物溶质7的典型浓度。上有物理多次审查和原则基础HPF， 如 1，7，8。HPF后，将样品在低温下（-78.5℃培养至-90液体含有机溶剂的化学固定剂如四氧化锇，一般几天的存在C），＃176。在这样低的温度下，水的样品中的被替换的有机溶剂，通常是丙酮，甲醇1,9。因此，该过程被称为冷冻替代（FS）。然后将样品逐渐加热，并在这段时间内是固定的，通常用四氧化锇和乙酸双氧铀9。交联在低温下具有固定的被固定1分子的优点。 FS因此产生的优良品质相比，那些在室温下固定用常规的化学固定，特别是它导致改进的超微结构保存，保存较好的抗原的样品，并减少未结合的蜂窝部件10，11的损失。
最FS进行过长期的时间段，通常长达数天。这是特别TRUE对于植物样品12，13，14。麦当劳和韦伯开发的最新协议，大大降低了时间的FS从几天到几小时15。在他们的快速冻结取代（QFS）过程，FS进行超过3小时，而在超级快速的FS（SQFS）样品在90分钟内进行处理。通过这些方法产生的样品的质量比得上那些用传统的FS协议产生。我们已经通过了QFS协议植物样品的高通滤波器后的下游加工。这已被证明不仅节省时间，而且钱，QFS和SQFS使用，而不是昂贵的市售FS机常见的实验室设备。
植物组织往往是非常具有挑战性的透射电子显微镜做准备。平均来说，植物细胞是大于或者细菌或动物细胞。疏水性蜡质角质层厚的细胞壁，含有有机酸，水解酶和酚类ç大型充水空泡的存在ompounds可以占据多达90％的总细胞体积16，并且充气空间的存在严重降低了系统17的热传导性。另外，在植物的情况下，样品的厚度几乎总是超过20μm时，限制使用化学固定的。在这些厚度中，水的导热系数低的防止冻结速率大于约10,000℃/秒，在样品的中心。这个速度是必需的，以避免破坏性的六角形冰的形成（冰晶具有较低的密度大于10〜15纳米）8。总之，这些挑战存在于样品和随后的FS既适当冻结。尽管如此，冷冻固定是固定植物样品的最好方法。在这里，一个协议，用于HPF-QFS植物组织样本呈现。它集中于模型物种拟南芥 ，但也被用于与本氏烟草 。典型的结果表明，HPF-QFS产生SA同等质量的传统HPF-FS中的一小部分时间mples。用适当的调整，该协议也可以被用于其他相对较厚的生物样品。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里介绍的协议的成功在很大程度上依赖于该用户。首先，需要提前准备，以确保所有必要的材料都是现成的，并以足够的量来完成整个HPF-QFS运行。第二，用户必须迅速，从步骤到步骤移动以最小化的样品处理以有效的方式，从而减少改变的组织的天然状态。一旦样品被冻结，他们是脱水之前就必须让它们保持低温，所以必须小心，以避免任何处理，可以在不经意间升温的样品，例如，处理一个…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
加州大学伯克利分校的肯特麦当劳博士的善良和慷慨是极大的赞赏。我们感谢匿名审稿人非常有帮助的建议。伯奇 – 史密斯的实验室正在启动从田纳西大学的资金支持。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine | Technotrade International, Inc | HPF02 | With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display of freezing parameters |
| Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers | Technotrade International, Inc | 290 | |
| Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A | Technotrade International, Inc | 241-200 | |
| Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B | Technotrade International, Inc | 242-200 | |
| Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20 | Chart | ||
| Baker's yeast | The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production | ||
| Tooth picks | |||
| Thermocouple data logger EL-USB-TC | OMEGA Engineering Inc. | OM-EL-USB-TC | Replacement battery purchased separately |
| Temperature probe | Electron Microscopy Sciences | 34505 | |
| Heater block 12/13 mm | |||
| Rotary shaker | Fisher Scientific | 11-402-10 | |
| Leaf punch – Harris Uni-core 2.00 | Ted-Pella Inc. | 15076 | |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
| Cryogenic vials 2 mL | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Methanol | |||
| Blow dryer | |||
| Dry ice | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Acetone | |||
| Forceps | Several pairs |
References
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