Tandem Højtryks-Frysning og Quick Freeze Substitution af plantevævene for Transmission Electron Microscopy

Summary

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Abstract

Siden 1940'erne transmissions elektron mikroskopi (TEM) har leveret biologer med billeder af biologiske materialer ultra-høj opløsning. Men på grund af besværlige og tidskrævende protokoller, der også kræver erfaring i fremstilling af artefakt-fri prøver TEM ikke betragtes som en brugervenlig teknik. Traditionel prøveforberedelse for TEM anvendte kemiske fikseringsmidler til at bevare cellulære strukturer. Højtryks-frysning er cryofixation af biologiske prøver under højt tryk til at producere meget hurtige afkølingshastigheder derved isdannelse, hvilket er skadeligt for integriteten af ​​cellulær ultrastruktur begrænsning. Højtryks-frysning og fryse substitution er i dag de foretrukne metoder til fremstilling af den højeste kvalitet morfologi i harpiks sektioner for TEM. Disse metoder minimere artefakter, der normalt forbindes med konventionel behandling til TEM af tynde sektioner. Efter cryofixation det frosne vand i prøven er erstattet med væskeorganisk opløsningsmiddel ved lave temperaturer, en proces, der kaldes fryse substitution. Frys substitution udføres typisk over flere dage i dedikeret, dyrt udstyr. En nylig innovation tillader at processen være afsluttet i tre timer i stedet for de sædvanlige to dage. Dette sker typisk efterfulgt af flere dage mere med prøveforberedelse, der omfatter infiltration og indstøbning i epoxy før skæring. Her præsenterer vi en protokol der kombinerer højt tryk frysning og hurtig fryse substitution, der gør det muligt for plante prøve fiksering skal udføres inden for timer. Protokollen kan let tilpasses til at arbejde med andre væv eller organismer. Plantevæv er af særlig bekymring på grund af tilstedeværelsen af ​​kulsyreholdige rum og vandfyldte vakuoler, som hindrer isfri frysning af vand. Desuden er processen med kemisk fiksering er især længe i anlæg på grund af cellevægge hindrer indtrængen af ​​kemikalier til dybt i væv. Plantevæv er derfor particcielt udfordrende, men denne protokol er pålidelig og producerer prøver af højeste kvalitet.

Introduction

Vores viden om celle ultrastruktur kommer hovedsageligt fra elektronmikroskopi, som kan opløse detaljer i størrelsesordenen nogle få nanometer ^1. Trods bliver så magtfulde i opløsning TEM ikke anses brugervenlig, som prøveforberedelse kræver tidskrævende og besværlige protokoller, og kræver en vis ekspertise fra den praktiserende læge. Traditionel fiksering af prøver har kombineret brugen af ​​aldehyder og osmiumtetroxid før yderligere behandling, der omfatter dehydrering, indstøbning i harpiks og derefter sektionering at producere ultra-tynde sektioner, som derefter farvet med tungmetaller. Men det vides, at kemisk fiksering kan producere artefakter herunder proteinaggregering og tab af lipider ^1, og ændringer til membraner, der i sidste ende påvirke flere cellulære rum ^2. Disse artefakter er i høj grad tilskrives den langsomme fiksering og dehydrering ved stuetemperatur ^{3, 4, 5.}

<p class="Jove_content"> Cryofixation ved højt tryk frysning (HPF) undgår de fleste af de artefakter forårsaget af kemisk fiksering. Princippet om cryofixation er, at det sænker frysepunktet for vand ved 20 grader, sinker kimdannelse og vækst af iskrystaller, og forøger viskositeten af vand i en biologisk prøve, så cellulære bestanddele i det væsentlige immobiliseret ^{6, 7.} HPF nedsætter en prøvens temperatur til det flydende nitrogen, under meget højt tryk (210 MPa eller 2,100 bar) i millisekunder. Når gøres ordentligt HPF forhindrer dannelsen af ​​store iskrystaller, der kan forårsage store skader på celle ultrastruktur. HPF kan bruges til at fastsætte prøver på 100-200 um tykkelse ved typiske koncentrationer af biologiske opløste ^7. Der er mange anmeldelser på fysik og principperne bag HPF, fx ^{1, 7, 8.}

Efter HPF, prøverne inkuberes ved lav temperatur (-78,5 ° C til -90 &# 176; C) i nærvær af flydende organiske opløsningsmidler, der indeholder kemiske fikseringsmidler som osmiumtetroxid generelt til et par dage. Ved denne lave temperatur, er vandet i prøven erstattes af det organiske opløsningsmiddel, typisk acetone eller methanol, ^{1, 9.} Således er denne proces kaldes fryse substitution (FS). Prøven derefter gradvist opvarmes og i denne periode er fast, normalt med osmiumtetroxid og uranylacetat ^9. Tværbinding ved lave temperaturer har den fordel fastsættelse molekyler, som er immobiliseret ^1. FS frembringer derfor prøver af høj kvalitet i forhold til dem, der er fastsat ved konventionel kemisk fiksering ved stuetemperatur, navnlig det resulterer i forbedret ultrastrukturelle bevarelse, bedre bevarelse af antigenicitet og reduceret tab af ubundne cellebestanddele ^{10, 11.}

De fleste FS foretages over lange perioder, typisk op til flere dage. Dette er især truE for planter prøver ^{12, 13, 14.} En nylig protokol udviklet af McDonald og Webb reducerer tiden til FS fra flere dage til nogle få timer og ^15. I deres hurtige fryse substitution (QFS) procedure, er FS udføres over 3 timer, mens der i de super hurtige FS (SQFS) prøver behandles i 90 minutter. Kvaliteten af ​​prøver fremstillet ved disse metoder kan sammenlignes med dem, der er givet af de traditionelle FS protokoller. Vi har vedtaget den QFS protokol for nedstrøms forarbejdning af plantematerialer prøver efter HPF. Dette har vist sig at spare ikke kun tid, men også penge, som QFS og SQFS anvender fælles laboratorieudstyr i stedet for de dyre kommercielt tilgængelige FS maskiner.

Plantevæv er ofte meget udfordrende at forberede TEM. I gennemsnit planteceller er større end enten bakterier eller dyreceller. Tilstedeværelsen af ​​hydrofobe voksagtig neglebånd, tykke cellevægge, store vandfyldte vakuoler indeholder organiske syrer, hydrolaser og fenol Compounds som kan befinde sig op til 90% af det totale cellevolumen ^16, og tilstedeværelsen af tilsat rum alvorligt mindsker varmeledningsevne af systemet ^17. Yderligere, når det gælder planter, prøvetykkelsen næsten altid mere end 20 um, grænsen for brug af kemisk fiksering. Ved disse tykkelser, den lave varmeledningsevne af vand forhindrer frysning på mere end -10.000 ° C / sek i centrum af prøven. Denne sats er nødvendig for at undgå at beskadige sekskantede isdannelse (iskrystaller med en lavere tæthed og større end 10 til 15 nm). ⁸ Tilsammen udgør disse aktuelle udfordringer for både korrekt frysning af prøven og efterfølgende FS. Alligevel cryofixation er den bedste metode til fastsættelse plante prøver. Her er en protokol for HPF-QFS af plante vævsprøver præsenteres. Den fokuserer på den model, arten Arabidopsis thaliana, men har også været anvendt med Nicotiana benthamiana. De typiske resultater viser, at HPF-QFS producerer samples af tilsvarende kvalitet til traditionelle HPF-FS på en brøkdel af tiden. Med passende justeringer, kan denne protokol også anvendes til andre relativt tykke biologiske prøver.

Protocol

BEMÆRK: QFS procedure kræver ekstrem omhu og forsigtighed af brugeren, og vi fremhæve disse sikkerhedsforanstaltninger her som forsigtighedsregler og bemærkninger, hvor det er relevant. 1.Forberedelse til HPF Run Inden du begynder prøveforberedelse, tænde for højtryks-fryser efter producentens anvisninger. BEMÆRK: HPF enhed, der benyttes i denne protokol er et Wohlwend Compact 02 enhed (figur 1A), og det tager cirka 12:59-og-en-halv times opstart pr…

Representative Results

Resultaterne nedenfor er opnået ved hjælp af en Wohlwend Compact 02 for HPF (figur 1A). En væsentlig fordel ved dette instrument er brugervenligheden af ​​prøven luftfartsselskaber og dets ejere. Ved brug af andre instrumenter, McDonald anbefaler, at to brugere skal foretage prøveforberedelse og HPF, en tilberedning af prøverne, mens den anden gør indefrysning og overførsel til FS kryohætteglas 9. Den Wohlwend aftryk Men luftfartsselskaber og indehaveren er let nok for en enkelt …

Discussion

Succesen med den protokol, der præsenteres her er meget afhængig af brugeren. Først avanceret forberedelse nødvendig for at sikre, at alle nødvendige materialer er let tilgængelige og i tilstrækkelig mængde til at fuldføre en hel HPF-QFS løb. For det andet skal brugeren arbejde hurtigt, bevæger sig fra trin-for-trin på en effektiv måde, der minimerer prøvehåndtering og derved minimere ændringer i den native tilstand af vævet. Når prøverne fryses og før de er dehydreret er det bydende nødvendigt, at …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine	Technotrade International, Inc	HPF02	With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display  of freezing parameters
Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers	Technotrade International, Inc	290
Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A	Technotrade International, Inc	241-200
Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B	Technotrade International, Inc	242-200
Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20	Chart
Baker's yeast			The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production
Tooth picks
Thermocouple data logger EL-USB-TC	OMEGA Engineering Inc.	OM-EL-USB-TC	Replacement battery purchased separately
Temperature probe	Electron Microscopy Sciences	34505
Heater block 12/13 mm
Rotary shaker	Fisher Scientific	11-402-10
Leaf punch – Harris Uni-core 2.00	Ted-Pella Inc.	15076
Pink dental wax	Electron Microscopy Sciences	72660
Cryogenic vials 2 mL	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Methanol
Blow dryer
Dry ice
Liquid nitrogen
Acetone
Forceps			Several pairs