탠덤 고압 냉동 및 투과 전자 현미경을위한 식물 조직의 빠른 동결 교체
Summary
Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.
Abstract
1940의 투과 전자 현미경 (TEM)이 생물학적 물질의 초 고해상도 이미지로 생물을 제공하고 있기 때문이다. 그러나 때문에 또한 잡티 무료 샘플의 준비 경험을 요구 힘들고 시간이 많이 소요되는 프로토콜로, TEM은 사용자 친화적 인 기술로 간주되지 않습니다. TEM 용 샘플 준비 전통적인 셀룰러 구조를 보존하는 화학 고정 제를 사용했다. 고압 동결시켜 세포 미세 구조의 완전성에 불리하다 얼음 형성을 제한하는 매우 빠른 냉각 속도를 생성하기 위해 높은 압력 하에서 생물학적 시료의 cryofixation이다. 고압 냉동 동결 치환은 현재 TEM에 대한 수지 부분에서 최고 품질의 형태를 생산하는 선택의 방법이 있습니다. 이러한 방법은 일반적으로 얇은 부분의 TEM에 대한 기존의 처리와 관련된 유물을 최소화 할 수 있습니다. cryofixation 후 샘플에 얼어 붙은 물이 액체로 대체된다낮은 온도에서 유기 용매, 공정은 동결 치환했다. 동결 대체는 일반적으로 전용, 비용이 많이 드는 장비 며칠 동안 실시한다. 최근의 혁신 대신 보통 이틀, 처리 3 시간에 완료 될 수있다. 이것은 일반적으로 침투와 단면 전에 에폭시 수지에 삽입을 포함 샘플 준비의 더 몇 일 뒤에. 여기에서 우리는 식물 샘플 고정이 시간 내에서 수행 할 수 있도록 고압 동결 빠른 동결 대체를 결합하는 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 쉽게 다른 조직 또는 유기체 작업에 적용 할 수 있습니다. 식물 조직 때문에 물이 얼음이없는 동결을 방해 화난 공간과 물이 채워진 공포의 존재의 특별한 관심사이다. 또한, 화학 물질의 정착 과정은 조직 내 깊은 곳으로 화학 물질의 침투를 방해 셀 벽으로 인해 공장에서 특히 길다. 식물 조직 따라서 partic 아르ularly 도전,이 프로토콜은 신뢰성과 최고 품질의 샘플을 생산하고 있지만.
Introduction
세포 미세 구조에 대한 지식은 몇 나노 미터 (1)의 범위에서 상세 해결할 수 전자 현미경, 주로 온다. 샘플 준비 시간과 노력이 많이 소요된다고 프로토콜을 필요로하며, 실천에서 약간의 전문 지식을 필요로 해상도 TEM에 강력에도 불구하고, 사용자 친화적으로 간주되지 않습니다. 샘플의 전통적인 고정 수지에 삽입 한 후 다음 중금속 묻 얇은 섹션을 생산하는 단면, 탈수가 포함되어 추가 처리 전에 알데히드 및 산화 오스뮴의 사용을 결합했다. 그러나, 화학 고정 궁극적 여러 셀룰러 구획이 멤브레인에 영향을주는 단백질 응집 및 지질 (1)의 손실, 및 변화를 포함 아티팩트를 생성 할 수 있다고 알려져있다. 이러한 아티팩트는 주로 상온 3, 4, 5로 고정 및 탈수 느린 레이트에 기인한다.
<p class="jove_content은"> 고압 냉동 (HPF)에 의해 Cryofixation 화학 고정에 의한 유물의 대부분을 방지 할 수 있습니다. cryofixation의 원리는 7. HPF가 감소, 20도에서 물의 빙점을 낮추는 얼음 결정의 핵 생성 및 성장을 느리게 및 세포 성분이 본질적 6 고정화되도록 생물학적 샘플에서 물의 점도를 증가 시킨다는 것이다 밀리 초 단위로 매우 높은 압력 (210 MPA는 또는 2100 줄)에서 액체 질소의 그것과 샘플의 온도. 제대로 완료되면 HPF 세포 미세 구조에 큰 손상을 일으킬 수 있습니다 대형 얼음 결정의 형성을 방지 할 수 있습니다. HPF는 생체 (7)의 전형적인 용질 농도로 100-200 μm의 두께의 샘플을 고정하기 위해 사용될 수있다. HPF, 예를 들어 1, 7, 8을 기본 수많은 물리학에 대한 리뷰와 원칙이 있습니다.HPF 후, 샘플은 -90 낮은 온도에서 (-78.5 ° C를 배양일반적으로 몇 일 동안 산화 오스뮴과 같은 액체의 유기 용매를 함유하는 화학 고정 제의 존재 하에서 C) # 176. 이 저온에서, 샘플은 물, 유기 용매, 통상적으로 아세톤, 메탄올 또는 1, (9)에 의해 대체된다. 따라서,이 프로세스가 호출 동결 치환 (FS). 샘플을 서서히 가온하고이 시간 동안 보통 산화 오스뮴과 우라 닐 아세테이트 (9), 고정된다. 저온에서 가교 결합을 고정화 한 분자를 고정하는 장점을 갖는다. FS 따라서이 개선 된 미세 보존 결과 특히 실온에서 기존의 화학 고정에 의해 고정와 비교 우수한 품질, 항원을 더 잘 보존 샘플을 생산하고 언 바운드 세포 성분 10, 11의 손실을 감소시켰다.
대부분의 FS는 일반적으로 몇 일까지 장기간에 걸쳐 수행된다. 이것은 특히 TRU 인식물 시료 12, 13, 14에 대한 전자. 맥도날드와 웹이 개발 한 최신 프로토콜은 크게 몇 시간 15 몇 일에서 FS의 시간을 줄일 수 있습니다. 슈퍼 빠른 FS에서 (SQFS) 샘플 90 분 안에 처리되는 동안 자신의 빠른 동결 치환 (QFS) 절차에서는 FS는 3 시간에 걸쳐 실시된다. 이러한 방법에 의해 생산 된 샘플의 품질은 전통적인 FS 프로토콜에 의해 수득 된 것과 대등하다. 우리는 HPF 후 식물 시료의 하류 처리 QFS 프로토콜을 채택했다. QFS 및 SQFS 대신에 비용이 많이 드는 시판 FS 기계의 일반적인 실험 장비를 사용할 때이 시간뿐만 아니라 돈뿐만 아니라 저장 입증되었습니다.
식물 조직은 종종 TEM을 준비하는 것은 매우 도전이다. 평균적으로, 식물 세포는 세균이나 동물의 세포 하나보다 큰. 소수성 왁스 표피 두꺼운 셀 벽, 유기산, 가수 분해 및 페놀 C를 함유하는 큰 물이 채워진 액포의 존재ompounds 즉 전체 세포 부피 (16)의 90 %까지 점유 할 수 있고, 통기 공간의 존재는 심각한 시스템 (17)의 열 전도성을 감소시킨다. 또한, 식물의 경우, 샘플 두께는 거의 항상 20 μm의 화학적 고정의 사용 한계를 초과한다. 이러한 두께에서, 물의 낮은 열전도율은 시료의 중심에 동결 속도보다 더 -10,000 ° C / sec의 방지한다. 즉, 환율을 손상 육각형 얼음 형성 (낮은 밀도의 얼음 결정 및보다 큰 10-15 나노 미터)를 방지하기 위해 필요 8. 이와 함께 샘플 및 후속 FS 모두 적절한 동결 이러한 본 과제. 그럼에도 불구하고, cryofixation 식물 샘플을 고정하기위한 가장 좋은 방법입니다. 여기에서 식물 조직 샘플의 HPF-QFS위한 프로토콜이 제시된다. 이 모델 종 애기 장대에 초점을 맞추고, 또한 Nicotiana의 benthamiana와 함께 사용되어왔다. 전형적인 결과는 HPF-QFS는 SA를 생성 입증짧은 시간에 전통 HPF-FS에 필적하는 품질의 mples. 적절한 조정으로,이 프로토콜은 또한 다른 비교적 두꺼운 생물학적 시료에 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 프로토콜의 성공은 사용자에 크게 의존한다. 첫째, 고급 준비가 필요한 모든 재료가 쉽게 사용할 수 전체 HPF-QFS 실행을 완료 할 수있는 충분한 양에 있는지 확인해야합니다. 둘째, 따라서 사용자는 조직의 고유 상태의 변경을 최소화 시료 처리를 최소화하는 효율적인 방식으로 공정 간 이동 단계에서 신속하게 작동한다. 샘플은 동결하고 탈수되기 전에주의를 실수로 예를 들어, 샘?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
UC 버클리 박사 켄트 맥도날드의 친절과 관용이 크게 감사합니다. 우리는 매우 유용한 제안에 대한 익명의 검토를 부탁드립니다. 버치 스미스 연구소는 테네시 대학에서 창업 자금을 지원합니다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine | Technotrade International, Inc | HPF02 | With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display of freezing parameters |
| Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers | Technotrade International, Inc | 290 | |
| Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A | Technotrade International, Inc | 241-200 | |
| Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B | Technotrade International, Inc | 242-200 | |
| Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20 | Chart | ||
| Baker's yeast | The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production | ||
| Tooth picks | |||
| Thermocouple data logger EL-USB-TC | OMEGA Engineering Inc. | OM-EL-USB-TC | Replacement battery purchased separately |
| Temperature probe | Electron Microscopy Sciences | 34505 | |
| Heater block 12/13 mm | |||
| Rotary shaker | Fisher Scientific | 11-402-10 | |
| Leaf punch – Harris Uni-core 2.00 | Ted-Pella Inc. | 15076 | |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
| Cryogenic vials 2 mL | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Methanol | |||
| Blow dryer | |||
| Dry ice | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Acetone | |||
| Forceps | Several pairs |
References
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