여러 제브라 피쉬에의 약국 (FDA)의 새로운 방법 ( 다니오의 레 리오 (rerio))와 철수의 정량화

요약

물고기를 약물에 노출시킬 때 변동성을 줄이는 새로운 방법을 설명합니다. 다양한 패턴의 에탄올 노출에 노출된 물고기는 밝은/어두운 스코토택시 분석에서 금단 기간 동안 불안 수준이 변화된 것으로 밝혀졌습니다.

초록

제브라피쉬의 불안 테스트는 종종 약리학적 물질의 적용과 함께 연구됩니다. 이 연구에서 물고기는 일상적으로 그물에 걸려 가정용 수족관과 투여 탱크 사이에서 운송됩니다. 화합물 투여의 용이성을 향상시키기 위해, 약물 투여를 위해 탱크 간에 물고기를 옮기는 새로운 방법이 개발되었습니다. 산란을 위해 설계된 삽입물을 사용하여 물고기 그룹을 약물 용액으로 옮겨 그룹 내의 모든 물고기를 정확하게 투여할 수 있었습니다. 이는 투여의 정밀도와 효율성을 증가시켜 반복적인 약물 투여의 긴 일정에서 매우 중요합니다. 우리는 21일 일정이 다른 에탄올을 투여한 후 밝은/어두운 테스트에서 제브라피쉬의 행동을 조사하는 연구에 사용하기 위해 이 절차를 구현했습니다. 매일 적당량의 알코올에 노출된 물고기의 경우, 금단 2일 후 대조군과 비교할 때 위치 선호도에 상당한 차이가 있었습니다. 그러나 매주 폭식 투여에 노출된 그룹에서 위치 선호도에 대한 유의한 차이는 관찰되지 않았습니다.

이 프로토콜은 수용성 화합물의 모든 유형과 함께 사용하도록 일반화 될 수 있으며 긴 약물 투여 일정 중 또는 그 이후의 물고기의 행동을 검사 할 때 모든 상황에서 사용할 수 있습니다. 라이트/다크 테스트는 또한 금단 증상으로 인한 불안의 변화를 평가하는 유용한 방법입니다.

서론

제브라 피쉬 (다니오 레 리오 (rerio)는) 행동 ¹ 및 의료 연구 ^2,3를위한 유용한 모델 생물 인도에서 발생하는 작은 경골 종입니다. 제브라 피쉬는 또한 일반적으로 거동에 미치는 영향을 특성화하기 위해 다양한 약리 물질의 시험에 사용된다. 다양한 투여 량 및 약물 투여 스케줄 같은 자극제 ^{4, 5} 및 항불안제 에탄올 ^6-8과 같은 화합물의 투여 후 지브라 피쉬의 거동을 조사하기 위해 사용되어왔다.

우리 연구소는 또한 일반적으로 scototaxic 분석이라 잘 검증 빛 / 어둠 분석 ^{9, 20,에} 제브라 피쉬의 불안과 운동에 에탄올 관리의 일정을 다른의 효과를 조사했다. 에탄올 투여 새로운 방법은 장기간 (이십일일) ⁶ 위에 반복적 인 매일 투여 효율성을 높이기 위해 개발되었다 까지. 이전에 사용 된 방법은 그러나, 우리는 관련 시간 비용, 그물 감소 방법을 개발하고자, 물고기 많은 관심 약물의 동시 투여를 정확하게 타이밍 허용 실용적이었다. 기존의 연구를 사용하여 에탄올, 제브라 피쉬는 그물로하고 에탄올과 물을 ^{10 ~ 12의} 적절한 혼합물을 포함하는 다른 하나의 탱크에서 전송. 이 방법은 널리 알려진 방법이지만, 제브라 피쉬 그물 것은 도입 약액으로부터 물고기를 제거하는 데 걸리는 시간에 변동을 증가시킬 수있다. 따라서 관심의 화합물에 대한 정확한 노출을 반복 투여를 포함하는 실험의 과정을 통해 달라질 수 있습니다. 전송 시대에 변화에 따른 오류의 원인을 감소시키는 방법은, 따라서 바람직하다. 우리의 방법으로 우리는 각각의 물고기 동일 투여 시간의 결과로, 동시에 모든 물고기를 이동 할 수 있습니다. (여기에 설명 된)을 에탄올 노출 후, 제브라 피쉬 어떤 접점에서 시험 될 수있다불안을 평가하는 것을 포함하여 행동 분석의 R. 새로운 방법을 사용하여 물고기의 그룹을 투여하는 것은 정확하게 복제 및 물고기의 그룹 주제 사이에 걸쳐 투여를 표준화 할 수있는 기능을 넘어 실제적인 용도를 가지고있다. 연구자들은 실험에서 반복 가능성과 정확성을 보장하기 위해 우리의 방법을 이용하여 볼 수 있습니다 한 번에 여러 물고기의 추적을 허용 새로운 소프트웨어의 등장. 생물 심리학위한 모델 생물로서 지브라 피쉬의 광범위한 사용을 고려하면,이 방법은 향후 약리 시험에서의 효율과 실용성을 증가시킬 것이다.

본 패러다임에서, 반복 투여 일정은 대략 인간 마시는 일정을 반영 것을 사용 하였다. 제어, 매일 중등도, 또는 매주-파티 : 생선은 무작위로 1 ~ 3의 그룹에 할당되었다. 투약 일정은 크게 기존의 연구 ⁷ 노출 시간을 초과했기 때문에 선택, 기간 21 일이었다. 제어 물고기는 제로 ALCO을 받았습니다HOL, 매일 적당한 물고기는 하루에 한 번 0.2 %의 알코올을 받고, 주간 - 파티 물고기는 일주일에 1.4 %의 알코올을 한 번 받았다. 빛 / 어둠 작업은 철수 2 일 후에 불안을 평가하기 위해 사용되었다. 이것은 한쪽 벽이 백색과 다른쪽에 ⁹ 어둡게되는 직사각형 경기장을 사용하는 관리하는 비교적 간단한 테스트이다. 성인 제브라 피쉬는 견고하게 제어 조건 ^6,9,13에서 경기장의 어두운면을 선호한다. 증가 불안은 작동에 어두운 영역에서 보낸 훨씬 더 많은 시간으로 정의하고, 물고기가 빛 영역에서 소비 상대적으로 더 많은 시간을 소비 할 때 불안을 가정 할 수 감소. 모션 추적 소프트웨어를 다른 정보 변수는 평균 속도, 부동, 사행 포함, 정량화 및 영역 ^(14)을 전환 할 수 있습니다.

우리 실험실에서 개발 된 투여 방법은 수용성 화합물은 하나 이상의 zebrafi에게 투여되는 임의의 연구에 적용 할 수있다SH. 이 방법론 혜택을 누릴 수있는 많은 다른 약리 에이전트는 현재 제브라 피쉬에서 테스트되고있다. 일반적으로 시험 화합물을 에탄올과 유사한 방식에 용해 니코틴 chlordiazepoxide, 부스 피론 및 스코 폴라 민을 포함한다; 물에 화학 물질의 적절한 양을 혼합함으로써. 따라서,이 절차의 일반적인 범위는 훨씬 더 넓은 및 에탄올에 제한되지 않는다. 또한, 여러 일에 대한 약물 투여 후, 빛 / 어둠 작업이 이용 될 수있는 많은 행동 검사 중 하나입니다. 약물 투여 후 또는 철회 동안 이용 될 수있는 다른 인기있는 분석은 새로운 탱크 다이빙 테스트 ⁽¹⁵⁾ 및 ⁽¹⁶⁾ 천수와 같은 사회적 행동의 테스트를 포함한다. 다음 절차를 반복 관심 약리 화합물을 함유 한 용액에 물고기 또는 물고기 개별 그룹을 전송하는 효율적인 방법을 개설 할 것이다. 또한, 빛 / 어둠 테스트와 시험 불안의 과정알코올 투여 긴 스케줄에 노출 된 후 철수에 물고기의 그룹으로 설명한다.

프로토콜

모든 절차 및 행동 시험은 관리 및 실험 동물의 사용을 위해 동물 관리의 가이드 라인에 대한 캐나다 협의회 준수 프로토콜 번호 06-11-12, 아래 MacEwan 대학의 동물 연구 윤리위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 정량 주입 탱크, 솔루션 및 관리 일정을 준비

1. 동물은 동일한 환경에서 시각적 자극에 시간이나 편향 어떤 혼동을 피하기 위해 하루 중 같은 시간 동안 투여되도록 관리 스케줄을 준비한다.
2. 그룹 크기의 수를 필요한만큼 동일, 1.5 L, 명확한 폴리 프로필렌 산란 탱크를 얻습니다. 물고기의 2 그룹에 대한 수 탱크 당 8 물고기의 사용 그룹이 과정에서 나중에 하루에 테스트 할 (3 단계 참조). 하나의 저장 탱크 및 그룹 당 하나의 투여 탱크 (그룹의 2 배 총 수)를 사용합니다.
   1. 모든 저장 탱크에 400 μm의 산란 삽입을 놓습니다. F병 서식지 물이나 올바른 온도에서 삼투 물을 역으로 탱크 (제브라 피쉬를 들어, 25 ~ 28 ° C) 온도 생선과 일치 일반적으로 수용된다.
      주 : 일부 약물과 버퍼 서식지 물의 화학 성분 사이의 바람직하지 않은 화학적 상호 작용이있을 수 있습니다. 이 상황에서, 역방향 약물 투여없이 또는 최소한의 수족관 염 버퍼링 삼투 물뿐만 아니라위한 대조군을 사용한다.
   2. 탱크 투여하는 동안 외부의 시각적 자극에 대한 조절 물고기를 방지하기 위해 중립적 인 환경에 있는지 확인하십시오.
3. 약물 솔루션을 준비합니다. 산란 탱크에 서식지 물과 약물의 적절한 양을 섞는다. 물 1497 ㎖로 높은 등급의 에탄올 (95 % 비 - 변성 에탄올) 3 ㎖를 조합하여 0.2 % 에탄올 용액을 준비한다. 물 1479 ml의 에탄올 21 ml에 결합하여 1.4 % 에탄올 용액을 준비합니다.

2. 그물 물고기와 잇한올 관리 절차

1. 조심스럽게 그물 서식지 탱크에서 물고기와 산란 삽입을 포함하는 적절한 보관 탱크에 전송. 이상적으로, 모두 그물 제거하기 위해 산란 삽입에 물고기를 집.
2. 각각의 물 탱크에있는 모든 물고기와 부드럽게 산란이 유지 탱크에서 삽입하고 적절한 약액 탱크 (그림 1A)에 배치 올립니다.
   1. 필요에 따라 투약 시간을 기록한다. 여기에 기재된 절차에 대한 에탄올 용액에 30 분을 사용한다.
   2. 가능한 경우, 단말기는 정확한 투약 시간을 보장하기 위해 동시에 약액에 모든 실험군의 전달에 도움이있다. 이와 달리, 한 번에 하나의 그룹을 전송하고 각각의 그룹의 투여 시간 (도 1a)을 추적.
3. 필요한 투여주기의 끝에서, 신중 산란 삽입물을 올려서 에탄올 용액으로부터 물고기를 제거약액 부드럽게 다시 보유 탱크로 배치 아웃.
4. 물 탱크에 물고기와 다음 예약 된 투약 시간까지 다시 서식지로 배치, 또는 산란이 그물을 제거하기 위해 다시 저장 탱크에 삽입 배치 조심스럽게 그물.
5. 동물 하우징 장비, 집 보유 탱크로 사용되는 탱크와 같은 산란 인서트 동물 매개 변수 내에서 이전에, 가능한 한 바와 같이. 이 관리 절차를 수행하는 동안 모두 그물 제거됩니다.

3. 행동 테스트

1. 길이 55cm 흰색 방수 바닥 (그림 1B)와 깊이 9.5 cm에서 9.5 cm 폭 빛 / 어둠 무대를 얻습니다. 경기장 흰색에 덮여와 반 검은 색으로 덮여의 절반, 벨크로를 사용하여 경기장의 내부 벽에 흰색과 검은 색 방수 비 반사 종이를 부착합니다. 25 ~ 28 ° C의 온도에서 서식지 물 5cm의 깊이로 무대를 채 웁니다. MAINT테스트를 통해 온도를 줄 알아.
2. 경기장에 위치해 위해 흰색 3면 인클로저를 구성하여 외부의 시각적 자극을 Minimalize. 시험 영역은 물 표면에 반사가 발생하지 않습니다 오버 헤드 조명을 확산이 아직 충분히 이동 추적 소프트웨어, 또는 게시물에 대한 밝은 확인 비디오 이미지에서 -hoc 설명서를 정량화.
3. 인클로저에 경기장을 배치하고 동작 추적 소프트웨어의 기록 및 운동 분석 매개 변수를 설정합니다. 연구 문제에 따라 5 ~ 15 분으로 시험 시간을 설정합니다.
   참고 : 여기에, 우리는 5 분을 사용했다.
4. 물고기의 그룹이 서식지 탱크의 연구 영역으로 테스트 할 전송 및 경기장 인클로저의 외부에 배치합니다. 10 분 동안 물고기를 적응.
5. / 암 분야의 중심에 적절한 그룹과 장소에서 부드럽게 그물 물고기가 AVO하는 경기장의 장축에 평행하게 위치 할 때 어류를 해제해야 되밝거나 어두운 영역에 물고기를 바이어스 ID입니다.
6. 동물이 출시 직후 기록 동작을 시작합니다. 물고기를 추적하거나 점프 물고기 또는 동결에 대한 소프트웨어 문제에 대한 조심. 대상자의 절반 인해 경기장의 끝이 인클로저의 오픈 엔드를 지향하는로 인한 편견에 어떤 혼동을 방지하기 위해 테스트 한 후 무대를 180도 회전합니다.
7. 재판은, 부드럽게 그물 종료 및 저장 탱크 또는 서식지 탱크 경기장에서 물고기를 제거 후.

4. 분석

1. 어두운 영역에 비해 빛에 소요되는 시간을 검사합니다. 각 그룹 및 각 물고기의 경우, 빛과 어두운 영역에서 소비 된 상대 시간을 획득하고 하나의 샘플 T는 - 테스트를 사용하여 분석 (또는 윌 콕슨은 비모수 데이터 signed rank test를, 차이를 총 시험 시간 (하프) 150 초에서) 그룹이 크게 다른 이상 한 지역을 선호하는 경우 확인합니다.
2. prefe을 계산, 환경 설정을 비교하려면어두운 영역에서 소요 된 시간에서 광 영역에서 소요과 그룹 간의 차이를 비교하는 시간을 감산함으로써, 보험료 인덱스. T- 테스트는 두 그룹을 비교하는데 사용될 수있다. Tukey의 HSD 포스트 특별 시험을 활용하여 분산의 한 방법으로 분석을 여러 그룹을 비교하여 필요한 경우 (던의 다중 비교 비모수 데이터에 대한 사후 테스트 또는 크루스 칼 - 월리스 테스트).
3. 그룹간에 속도, 사행 영역 전환, 수, 부동 비교. Tukey의 HSD 포스트 혹 시험을 이용 일원 변량 분석을 사용하여 필요한 경우 (던의 다중 비교 비모수 데이터에 대한 사후 시험 또는 크루스 칼 - 월리스 시험).

결과

상기 한 바와 같이이 일관되고 정확하게 시간에 에탄올 관리의 지속 시간 중요하다 제브라 피쉬와 약리 연구의 정확성과 제어를 유지합니다. 우리의 절차는 절차 투여의 용이성 및 처리량을 증가시킬 수있다. 주간-파티 또는 매일 중등도 중 일정에 에탄올을 투여 대조군과 비교, 빛 / 어둠 테스트로 측정 변경된 불안 수준, 결과. 이틀 마지막 투여 후 시험 할 때, (어떤 술을받은,하지만 여전히 투여 탱크로 이동 한) 대조군 제브라 피쉬는 (경기장의 어두운면에 제어 물고기 지출 훨씬 더 많은 시간과 행동의 예상 패턴을 표시 다른 연구 ^6,9,13에서 순진 제브라 피쉬와 유사한 그림 2A). (그림 2B 마지막 에탄올 투여 후 2 일 시험했을 때 주간 파티 그룹의 물고기는 작업에 밝거나 어두운 두 영역에 대한 선호를 보이지 않았다 (그림 2C)의 빛 쪽을 선호; 대조군 대조적. 환경 지수는 제어 및 매일 적당한 그룹 (그림 2D) 사이에 유의 한 차이가 나타...

토론

제브라 피쉬에서 약물 투여와 관련된 이전의 연구는 단순히 약물 솔루션 ^{(12, 16)에} 자신의 집 탱크에서 그들을 수송하는 물고기를 그물에 의존했다. 그물은 항상 일치하지 않습니다 종종 인해 상당한 약간의 차이가있는 제브라 피쉬의 탈출 응답하는 데 예상보다 시간이 오래 걸립니다. 기존의 전송 방법은, 유용하지만, 물고기가 물 이외의 총 소요 시간의 양을 감소뿐만 아니라 동물 간의 전송 시간에 변동의 양을 감소시킴으로써으로 향상 될 수있다. 실용성을 향상시킬뿐 아니라,이 방법은 연구자에게 동시에 시간의 정확한 양 용액 물고기의 큰 그룹을 투약 할 수있는 능력을 준다. 이전 방법 중 하나는 하나의 물고기를 투여, 또는 동시에 물고기의 그룹을 전체 그물을 시도해야합니다. 후자는 어색하고 어려운 작업 인 반면 전자는 느리고 처리량을 감소시킨다. 또한, 모션 추적 시스템이 C이 방법의 정밀도 혜택을 누릴 수 있습니다 한 번에 여러 물고기의 행동을 평가. 물고기는 모든 물고기 경기장에 동시에 노출 근처에 확인 할 천수...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3단 선반 벤치탑 하우징 시스템	Aquatic Habitats	N/A
400 μm 배플이 포함된 1.5 L 산란 탱크	Aquatic Habitats	N/A
순수 곡물 에탄올	Luxco, INC	N/A
Ethovision XT 동작 추적 소프트웨어	Noldus Information Technology
피펫	Eppendorf Canada
명암 인식 장치(Light/Dark Arena)	Custom		절차 설명서에 따라 제작. 너비 9.5 cm, 깊이 9.5 cm, 길이 55 cm.