लेजर कैद Microdissection के साथ नाक बायोप्सी संयुक्त माध्यम से प्राप्त की घ्राण न्यूरॉन्स: मानसिक विकार में उपचार प्रतिक्रिया का अध्ययन के लिए एक संभावित दृष्टिकोण
Summary
इस अध्ययन में, एक उपन्यास प्लेटफार्म विकसित और मान्य किया गया था द्विध्रुवी विकार (बी) में इलाज प्रतिक्रिया की intraneuronal आणविक हस्ताक्षरों की जांच करने के लिए। बी.डी. रोगियों से घ्राण उपकला नाक बायोप्सी के माध्यम से प्राप्त हुई थी। तो लेजर कब्जा microdissection के बी.डी. में लिथियम प्रतिक्रिया की आणविक हस्ताक्षर की जांच के लिए रियल टाइम आरटी पीसीआर के साथ जोड़ दिया गया था।
Abstract
द्विध्रुवी विकार (बी) खराब समझ pathophysiology के साथ एक गंभीर neuropsychiatric विकार है और आम तौर पर मूड स्टेबलाइजर, लिथियम कार्बोनेट के साथ इलाज किया। जानवरों के अध्ययन के साथ-साथ मानव आनुवंशिक अध्ययन लिथियम न्यूरोनल विकास, अस्तित्व और परिपक्वता, और Wnt संकेतन में शामिल विशेष रूप से अणुओं में शामिल कर रहे हैं कि आणविक लक्ष्य को प्रभावित करता है कि संकेत मिलता है। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में लिथियम-प्रतिक्रिया के साथ जुड़े गतिशील आणविक परिवर्तन की जांच के लिए मस्तिष्क की बायोप्सी प्राप्त करने के लिए नैतिक चुनौती को देखते हुए, एक इस goal.The घ्राण उपकला घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स होते प्राप्त करने के लिए घ्राण ऊतकों से प्राप्त न्यूरॉन्स के उपयोग पर विचार कर सकते विकास और glial कोशिकाओं की तरह का समर्थन करने में विभिन्न चरणों में। यह सुरक्षित रूप से नाक बायोप्सी से प्राप्त घ्राण ऊतक का उपयोग कर, neuropsychiatric रोगों के साथ रोगियों के सीएनएस में गतिशील परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है। Subst से उत्पन्न दोष को दूर करने केगैर neuronal कोशिकाओं के साथ biopsied घ्राण ऊतक के antial संदूषण, समृद्ध neuronal सेल आबादी प्राप्त करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण लेजर कब्जा microdissection के साथ नाक बायोप्सी के संयोजन के द्वारा विकसित किया गया था। इस अध्ययन में, न्यूरोनल ऊतक में उपचार जुड़े गतिशील आणविक परिवर्तन की जांच के लिए एक प्रणाली लिथियम उपचार प्रतिक्रिया के आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए भर्ती बी.डी. रोगियों के एक छोटे से पायलट नमूना का उपयोग करते हुए, विकसित और मान्य किया गया था।
Introduction
द्विध्रुवी विकार (बी) के मूड में रोग परिवर्तन की विशेषता गंभीर neuropsychiatric विकार है, ड्राइव और अनुभूति 1। बी.डी. के इलाज के लिए इस्तेमाल किया लिथियम जानवरों के अध्ययन में 2 जीन की एक बड़ी संख्या के स्थिर राज्य mRNA के स्तर को बदलने के लिए दिखाया गया है, लेकिन इन अणुओं के किसी भी मनुष्य 2 में नैदानिक प्रतिक्रिया के साथ जुड़ा हुआ है अगर यह अनजान बनी हुई है। लिथियम प्रतिक्रिया के तंत्र को समझना न्यूरोनल ऊतकों में लिथियम प्रेरित आणविक परिवर्तन की जांच की आवश्यकता होगी। दुर्भाग्य से, यह बी.डी. रोगियों के मस्तिष्क बायोप्सी पूर्व और बाद लिथियम चिकित्सा लिथियम प्रतिक्रिया की आणविक हस्ताक्षरों की पहचान करने के लिए प्राप्त करने के लिए व्यावहारिक नहीं है। पोस्टमार्टम मस्तिष्क के ऊतकों बी.डी. में बायोमार्कर का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, हालांकि, वे भावनाओं, अनुभूति और ड्राइव में गतिशील परिवर्तन के साथ जुड़े आणविक मार्कर का आकलन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है; और पूर्वव्यापी निधारित लिथियम उपचार प्रतिक्रिया की वैधता समस्याग्रस्त किया जा सकता है 4। लिम्फोसाइटों और अन्य रक्त कोशिकाओं के लिए उपयोगी हो सकता है, लेकिन रक्त कोशिकाओं में आणविक परिवर्तन न्यूरोनल परिवर्तन 3-5 प्रतिबिंबित नहीं कर सकते। मस्तिष्कमेरु द्रव रोग से जुड़े और दवा-प्रतिवर्ती आंतरिक बदलाव को प्रतिबिंबित हो सकता है कि इंट्रासेल्युलर अणुओं के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए अपर्याप्त हो सकती है।
घ्राण उपकला (ँ) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) का एक अनूठा हिस्सा है, लिम्बिक संरचनाओं से 6 embryologically से संबंधित; और यह नाक बायोप्सी के माध्यम से आसानी से पहुँचा जा सकता है। यह होते हैं glial-जैसे विकास 7-9 के विभिन्न चरणों में (यानी, sustentacular) कोशिकाओं, बेसल proliferating कोशिकाओं, और घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स का समर्थन। इसलिए, ँ accessibly neuropsychiatric रोगों 7 के साथ रोगियों के सीएनएस में गतिशील परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है। अध्ययन उन ओसीसी को प्रतिबिंबित कि रोग जुड़ी घटनाओं की जांच के लिए एक किराए के ऊतकों के रूप में ँ की उपयोगिता का प्रदर्शन कर रहे हैंमस्तिष्क के न्यूरॉन्स 8,9 में urring। उदाहरण के लिए, पढ़ाई मनोरोग शर्तों 10-14 के साथ जुड़े आणविक प्रोफाइल को जांच करने के लिए ँ उपयोग किया है। घ्राण प्रणाली को भी इस तरह के एक प्रकार का पागलपन 15 के नकारात्मक लक्षण के साथ जुड़े रहे हैं कि गंध घाटे के रूप में नैदानिक endophenoytpes की पहचान करने के लिए कार्य करता है। इसके अतिरिक्त, neurodevelopmental प्रक्रियाओं मनोरोग शर्तों 8,9 की अंतर्निहित pathophysiology मॉडल करने के लिए एक उपयोगी एवेन्यू प्रदान करने, जीवन भर ँ में जारी है।
हालांकि, इस ऊतक के उपयोग के लिए एक दोष यह है कि गैर neuronal कोशिकाओं 16 के साथ घ्राण बायोप्सी की पर्याप्त संदूषण है। उदाहरण के लिए, पिछले ँ अध्ययन में जीन की अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता कुल शाही सेना गैर neuronal कोशिकाओं 17 से शाही सेना सहित पूरे नाक biopsied ऊतकों से निकाली गई शाही सेना निहित। इसलिए, पिछले दृष्टिकोण कोशिकाओं की गुणवत्ता द्वारा सीमित किया गया है। इस मुद्दे पर काबू पाने के लिए, एक उपन्यास दृष्टिकोण प्राप्त करने के लिए लेजर कब्जा microdissection (एलसीएम) के साथ नाक बायोप्सी के संयोजन से समृद्ध neuronal सेल आबादी 18 विकसित किया गया है।
एलसीएम बुनियादी लाल लेजर 19-21 के साथ संयुक्त यूवी लेजर काटने का उपयोग कोशिकाओं की चयनात्मक अलगाव के लिए अनुमति देता है कि एक तकनीक है। ँ दृष्टिकोण के साथ संयोजन एलसीएम जिससे neuronal कोशिकाओं 18 के संवर्धन बढ़ाने, गैर neuronal कोशिकाओं द्वारा ँ की पर्याप्त संदूषण को कम करता है। इसके अलावा, neuronal परत जिससे धुंधला के लिए दूर करने की जरूरत है, एक खुर्दबीन के नीचे submucosa परत से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। Neuronal सेल प्रकार आगे ब्याज 7 की सेल प्रकार से व्यक्त कर रहे हैं, जो प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग अन्य सेल आबादी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। इसलिए, इस प्रक्रिया जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन, immunohistochemistry और अन्य शब्द के भागों जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि लगभग पूरी तरह neuronal सेल आबादी के संवर्धन के लिए एक आसान विधि स्थापित करता है।
ve_content "> इस अध्ययन रोग राज्यों और उपचार की प्रतिक्रिया से जुड़े घ्राण न्यूरॉन्स में आणविक परिवर्तन की जांच के लिए एक प्रयोगात्मक मंच स्थापित करना है। यह पता करने के लिए, बी.डी. के लिए डीएसएम-चार नैदानिक मानदंडों से मुलाकात की, जो गैर धूम्रपान रोगियों के एक छोटे से सेट पर आधारित आनुवंशिक अध्ययन के लिए नैदानिक साक्षात्कार (डीआईजी) 22 दो नाक बायोप्सी से गुजरना करने के लिए भर्ती किया गया था: लिथियम और दूसरे बायोप्सी के साथ एक बायोप्सी पूर्व उपचार, दैनिक मौखिक लिथियम चिकित्सा के छह सप्ताह के बाद इसके अलावा, पात्र बी.डी. रोगियों होना चाहिए:। अवसाद के लिए प्रतीक मोंटगोमरी-Asberg रेटिंग स्केल (MADRS) 23 प्रशासित चिकित्सक में 60 से बाहर ≥10 स्कोरिंग के आधार पर, (YMRS) hypomania या उन्माद के लिए प्रतीक, युवा उन्माद रेटिंग स्केल प्रशासित चिकित्सक पर 56 से बाहर एक स्कोर ≥10 पर आधारित । 24;। MADRS और दोनों तराजू के लिए चिकित्सकों के बीच समझौते की YMRS रेटर-इंटर रेटर गुणांक दोनों पर या ≥10 बायोप्सी के बाद, न्यूरॉन्स enri 0.96 थे> हैएलसीएम द्वारा ँ से CHEd। ऊतक और neuronal संवर्धन से उच्च गुणवत्ता वाले शाही सेना की निकासी सुनिश्चित करने के लिए, अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण उपायों के बाद, रीयल टाइम आरटी पीसीआर ब्याज की जीन के पूर्व और बाद के उपचार अभिव्यक्ति के स्तर की जांच करने के लिए आयोजित किया गया था। आगामी वर्गों एक इस दृष्टिकोण के सत्यापन का विवरण, प्रोटोकॉल के अनुकूलन पर प्रकाश डाला और परेशानी की शूटिंग के प्रोटोकॉल के लिए लागू किया गया है कि रणनीतियों होते हैं।Protocol
Representative Results
Discussion
नाक बायोप्सी और एलसीएम के संयोजन से समृद्ध घ्राण न्यूरोनल परतों प्राप्त करने के लिए एक नया मंच प्रस्तुत किया है और इस अध्ययन में मान्य किया गया है। इस तकनीक को बड़े पैमाने पर प्रभाव पड़ सकता है। यह क्ष?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by USPHS grants MH-091460 (E.N.), MH-084018 (A.S.), MH-094268 Silvo O. Conte center (A.S.), MH-069853 (A.S.), MH-085226 (A.S.), MH-088753 (A.S.), MH-092443 (A.S.), and MH-096208 (K.I.), grants from DANA (E.N.), Stanley (A.S.), RUSK (A.S.), S-R foundations (A.S.), NARSAD (A.S. and K.I.), and Maryland Stem Cell Research Fund (A.S. and K.I.).
We sincerely appreciate the efforts and contributions of Pearl Kim, Maria Papapavlou, Nao Gamo, Youjin Chung, Yukiko Lema and Mark Christie towards coordination of the biopsy process.
Materials
| Reagent | Manufacturuer | Manufacturer Catalog # |
| Tissue Preparation | ||
| Tissue-Tek Cryomold Molds | Sakura Finetek | 4557 |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 |
| Cryosectioning | ||
| Membrane Slide 1.0 PEN (D) | Carl Zeiss Microscopy | 415190-9041-000 |
| Rnase Zap | Ambion | AM9780 |
| DEPC Treated Water | Quality Biological | 351-068-131 |
| Microdissection | ||
| Microscope: PALM Series MicroLaser System | Carl Zeiss Microscopy | |
| Model: Axiovert 200M | ||
| Software: Robo v3.2 | ||
| No.5 Dumont Microdissction Forceps | Roboz | RS-49085 |
| RNA Extraction | ||
| RNAqueous Micro Kit | Ambion | AM1931 |
| cDNA Synthesis | ||
| SuperScript III First Strand Synthesis Kit | Invitrogen | 18080-051 |
| OMP qPCR | ||
| SYBR GreenER qPCR SuperMix | Invitrogen | 11760-500 |
| Taqman qPCR | ||
| TaqMan Expression Assay Probes | Applied Biosystems | Various |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 |
References
- Goodwin, F. K., Jamison, K. R. . Manic-depressive illness. , (1990).
- Einat, H., Manji, H. K. Cellular plasticity cascades: genes-to-behavior pathways in animal models of bipolar disorder. Biol Psychiatry. 59 (12), 1160-1171 (2006).
- Severino, G., et al. Pharmacogenomics of bipolar disorder. Pharmacogenomics. 14 (6), 655-674 (2013).
- Beech, R. D., et al. Gene-expression differences in peripheral blood between lithium responders and non-responders in the Lithium Treatment-Moderate dose Use Study (LiTMUS). Pharmacogenomics J. 14 (2), 182-191 (2013).
- Horiuchi, Y., et al. Olfactory cells via nasal biopsy reflect the developing brain in gene expression profiles: utility and limitation of the surrogate tissues in research for brain disorders. Neurosci Res. 77 (4), 247-250 (2013).
- Dryer, L., Graziadei, P. P. Projections of the olfactory bulb in an elasmobranch fish, Sphyrna tiburo: segregation of inputs in the telencephalon. Anat Embryol (Berl. 190 (6), 563-572 (1994).
- Hahn, C. G., et al. In vivo and in vitro neurogenesis in human olfactory epithelium. J Comp Neurol. 483 (2), 154-163 (2005).
- Cascella, N. G., Takaki, M., Lin, S., Sawa, A. Neurodevelopmental involvement in schizophrenia: the olfactory epithelium as an alternative model for research. J Neurochem. 102 (3), 587-594 (2007).
- Sawa, A., Cascella, N. G. Peripheral olfactory system for clinical and basic psychiatry: a promising entry point to the mystery of brain mechanism and biomarker identification in schizophrenia. Am J Psychiatry. 166 (2), 137-139 (2009).
- Mor, E., et al. MicroRNA-382 expression is elevated in the olfactory neuroepithelium of schizophrenia patients. Neurobiol Dis. 55, 1-10 (2013).
- Kano, S., et al. Genome-wide profiling of multiple histone methylations in olfactory cells: further implications for cellular susceptibility to oxidative stress in schizophrenia. Mol Psychiatry. 18 (7), 740-742 (2013).
- Toritsuka, M., et al. Deficits in microRNA-mediated Cxcr4/Cxcl12 signaling in neurodevelopmental deficits in a 22q11 deletion syndrome mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17552-17557 (2013).
- Evgrafov, O. V., et al. Olfactory neuroepithelium-derived neural progenitor cells as a model system for investigating the molecular mechanisms of neuropsychiatric disorders. Psychiatr Genet. 21 (5), 217-228 (2011).
- Fan, Y., et al. Focal adhesion dynamics are altered in schizophrenia. Biol Psychiatry. 74 (6), 418-426 (2013).
- Ishizuka, K., et al. Negative symptoms of schizophrenia correlate with impairment on the University of Pennsylvania smell identification test. Neurosci Res. 66, 106-110 (2010).
- Sattler, R., et al. Human nasal olfactory epithelium as a dynamic marker for CNS therapy development. Exp Neurol. 232 (2), 203-211 (2011).
- Rimbault, M., Robin, S., Vaysse, A., Galibert, F. RNA profiles of rat olfactory epithelia: individual and age related variations. BMC Genomics. 10, 572 (2009).
- Tajinda, K., et al. Neuronal biomarkers from patients with mental illnesses: a novel method through nasal biopsy combined with laser-captured microdissection. Mol Psychiatry. 15 (3), 231-232 (2010).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).
- Fink, L., et al. Real-time quantitative RT-PCR after laser-assisted cell picking. Nat Med. 4 (11), 1329-1333 (1998).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Nurnberger, J. I., et al. Diagnostic interview for genetic studies. Rationale, unique features, and training. NIMH Genetics Initiative. Arch Gen Psychiatry. 51 (11), 849-859 (1994).
- Montgomery, S. A., Asberg, M. A new depression scale designed to be sensitive to change. Br J Psychiatry. 134, 382-389 (1979).
- Young, R. C., Biggs, J. T., Ziegler, V. E., Meyer, D. A. A rating scale for mania: reliability, validity and sensitivity. Br J Psychiatry. 133, 429-435 (1978).
