유동 세포 계측법에 의한 신장 상피 세포에서 세포 내 칼슘 측정
Summary
칼슘이 많은 생리 학적 및 병태 생리 학적 신호 전달 경로에 참여하고있다. 라이브 세포 이미징 전문 장비가 필요하고 많은 시간이 소요될 수 있습니다. 현탁액하게 부착 상피 세포에서 사이토 졸 칼슘의 상대적 변화를 결정하는 유동 세포 계측기를 사용하여 신속하고 간단한 방법을 최적화 하였다.
Abstract
A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.
Introduction
칼슘은 세포 생리 및 병리 생리 학적 신호 (1)의 전송을 담당하는 중요한 초 메신저. 세포질 칼슘 농도는 칼슘 펌프 및 칼슘 교환기의 활성을 낮게 유지된다. 근질 / 소포체 칼슘 ATP 아제 (SERCA)는 ATP 의존적 방식 모두에서 세포막 칼슘 ATPase를 (PMCA)는 세포 외 구획 칼슘 압출 반면 "펌프 누출"시스템의 일부로서 소포체 (ER) 칼슘 저장소 리필 2. 이러한 호르몬 또는 신경 전달 물질과 같은 생리 메신저, G 단백질 커플 링 수용체, 디아 실 글리세롤 및 이노시톨 트리 포스페이트 (IP3) (3)를 생성하는 세포막에 포스파티딜 이노시톨 4,5- 비스 포스페이트 (PIP2)을 가수 분해 포스 포 리파제 C의 활성화를 통해 신호를 전송한다. 디아 실 글리세롤은 세포막에 남아있는 반면, IP3은 세포질 내로 확산되어 IP3 수용체에 결합ER 막과 칼슘에서 발견 리간드 칼슘 채널 활성화의 (IP3Rs)는, 세포질 칼슘 농도 4의 증가에서 남중 소포체 내강 저장소에서 해제됩니다. 세포질에 도달하는 칼슘 대체 경로는 세포막에 존재하는 칼슘 채널 교환기 통해서이다. 이 두 구획 사이의 크로스 토크 설명 하였다 : 칼슘에 의한 칼슘의 세포 외 칼슘이 ER 저장 5에서 칼슘 방출을 유도 릴리스 (CICR), 저장이 STIM에 의해 감지 된 ER 저장 비우는 칼슘 항목 (SOCE)를 운영하고 Orai의 개방 원인 세포막에있는 칼슘 채널 ER 저장소 (6)의 재 충진을 촉진.
병태 생리 학적 조건 하에서, 세포 칼슘 응답 생리적 자극 (1)의 부재하에 탈과 사이토 졸 칼슘 증가이다. 칼슘 응답은 다수의 방식으로 영향을받을 수있다 : 칼슘 장기간신호, 세포질에서 칼슘 제거, 칼슘 저장 또는 칼슘의 지역화 변경의 고갈을 지연. 또한, 미토콘드리아는 버퍼링의 중심 역할을 수행하고 칼슘 (7)을 발표. 장기간 및 / 또는 supramaximal 세포질 칼슘 증가는 죽음을 셀에 연결됩니다. 사실, 칼슘보다 종종 셀룰러 병태 생리 학적 반응에 관여하며, 주로 세포 사멸과 관련된 신경 퇴행성 질병, 심장 질환, 암, 골 질환 및 신장 질환과 같은 질병의 광범위한 배열의 키 이벤트하지보다 손실 또는 장기 나 조직 기능 8-10의 변화와. 또한, 칼슘 신호의 섭동 셀룰러 적응 및 세포 기능과 응답의 변화에 연결되었다.
전통적으로, 칼슘 신호는 세포 투과성 아세 (AM) 에스테르 형태로 세포 내로로드 음전하 형광 칼슘 지표로 측정된다. 일단 세포 esteras에 의해 절단ES, 형광 지표 세포 내 구획 내에 남아 칼슘이 결합하면 형광 강도의 증가. 가장 잘 알려진 및 사용 칼슘 표시기는 비율 계량의 Fura-2 로저 첸과 동료 (11)에 의해 개발되고있다. 칼슘 : 서로 다른 친화력과 칼슘 지표는 다른 칼슘 풀을 모니터링 할 수 있습니다. 검출 방법은 살아있는 세포 이미징, 형광 마이크로 플레이트 리더를 포함 유동 세포 계측법. (일반적으로 분 몇 초 이내) 칼슘 신호의 상대적으로 빠른 반응 속도는 칼슘 신호의 특성에 대한 대부분의 정보를 얻는 가장 좋은 방법 이미징 살아있는 세포를 만든다. 이외에도 (밀리 초 이내) 칼슘 신호의 빠른 동역학에서, 생균 이미징은 단일 셀 (12) 내 칼슘 신호 전달의 셀룰러 구획화를 연구하기위한 더 나은 방법이다. 절대 칼슘 농도는 칼슘 산업사의 최소 및 최대 형광을 결정함으로써 계산 될 수있다Grynkiewicz 등. (11)에 의해 기술 된 바와 같이, 각각 칼슘 킬레이트 제를 첨가하고 세포를 permeabilizing 의해 icator.
칼슘 신호를 측정하기 위해 유세포의 사용은 제 기회는 막 무결성 및 세포 집단을 분리하고, 단일 파장의 개발과 결합 현탁액 중의 세포의 요건과 같은 여러 파라미터를 측정하는 위치를 면역 세포에서 1980 년대에 개발 된 칼슘 지표는 이상과 convenientdetection 방법 13-15 유동 세포 계측법을했다. 부착 세포에서는 생균 이미징 칼슘 시그널링, 가장 중요한 키네틱 관한 대부분의 정보를 제공하지만, 취득하는 온도 등의 형광 현미경, 관류 시스템, 셀룰러 환경의 유지를 포함하는 복잡한 설정 및 특수 현미경 소프트웨어가 필요 데이터 분석. 이러한 형광 마이크로 플레이트 리더 또는 pharmacol 등의 다른 방법칼슘 킬레이트의 사용을 통해 ogical 수단이 얻은 정보의 측면에서 비교할 수 있습니다. 유동 세포 계측법은 더 넓게, 대부분의 연구에 불구하고 측정이 수행되는 경우에만 최종 점 접착 세포에서 사이토 졸 칼슘을 모니터링하는 데 사용되어 가고있다. 초기 게르 겔리 등의 문헌에 의해 개발 된 방법을 사용. 면역 B 세포 (16)에 실시간 속도론과 유세포 및 샘플 모집단 개별 셀에서 형광 강도를 모니터링하여 세포질 유리 칼슘 농도의 변화가 성공적 경부암 상피 세포에서 측정 된 암 줄기 세포는 17 잡종. 이 방법은 더 칼슘 지표 (18)로드하기 어려운 부착 상피 세포에 사용하기 위해 적응했다.
여기서, 쥐 신장 근위 세뇨관 (c12에 WKPT-0293) (19)의 S1 세그먼트로부터 유도 된 무한 증식 자기편 상피 세포주를 사용하여, 우리는 최적의 간략화를 설명 m유동 세포 계측법에 의해 세포 내 칼슘 농도의 변화를 측정하는 ethod. 많은 상피 세포는 음이온 성 화합물에 대한 유기 운송의 번호를 가지고 있기 때문에, 칼슘 표시기 세포의 로딩은 도전이 될 증명할 수 있습니다. 칼슘 지표, 프로 베네 시드, 페니실린 (20)의 신장 배설을 감소하기 위해 개발 된 원래 원형 유기 음이온 수송의 억제제와의 유출을 방지하기 위해, 배양 매체에 동시에 적용된다. 세포는 칼슘 인디케이터 로딩 단층 유지 화합물 첨가 후 즉시 검출 할 수 현탁액 칼슘 신호로된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
칼슘은 제 메신저 신호 전달 분자로서, 또한 ER 및 미토콘드리아 사이에서 통신하기위한 수단으로 작용하는 다수의 세포 과정에 키 이벤트이다. 자유 세포질 칼슘 농도의 변화를 측정하는 능력은 세포 생물학의 모든 영역에 적용 할 수있는 유용한 기술이다. 사이토 졸 칼슘 신호를 검출하기위한 다양한 방법이있다. 고전 등의 Fura-2와 같은 칼슘 비율 계량 표시기로부터의 신호는, 형광 촬상 설정 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
실험실에서 연구 프리츠 – 벤더 재단, 뮌헨, 독일 (TD에)와 (W.-KL에) 위튼 / Herdecke 내부 연구비의 대학 재정 지원된다. 우리는 도움이 제안을 (생리학, 병태 생리 및 독성, 위튼 대학 / Herdecke 연구소) 교수 박사 박사 프랭크 Thévenod에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Fluo-3, AM | Invitrogen | F-1241 | Cell permeable |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P-8761 | Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Invitrogen | 25300-062 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| Thapsigargin | Tocris Bioscience | 1138 | |
| Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software | Becton Dickinson | ||
| Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI) | Joe Trotter, The Scripps Institute | Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data. | |
| WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line | Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH) |
References
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