Cytosoliske Calcium Målinger i Nyrer epitelceller ved flowcytometri
Summary
Calcium er involveret i mange fysiologiske og patofysiologiske signalveje. Live-cell imaging kræver specialiseret udstyr og kan være tidskrævende. En hurtig, enkel metode under anvendelse af et flowcytometer til at bestemme de relative ændringer i cytosolisk calcium i adhærerende epitelceller bragt i suspension blev optimeret.
Abstract
A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.
Introduction
Calcium er en vigtig second messenger ansvarlig for transmission af cellulære fysiologiske og patofysiologiske signaler 1. Cytosoliske calciumkoncentrationerne holdes lavt gennem aktiviteten af calcium pumper og calcium vekslere. Det sarkoplasmiske / endoplasmatiske reticulum calcium ATPase (SERCA) genopfylder det endoplasmatiske reticulum (ER) calcium lager som del af en "pumpe lække" system, hvorimod plasmamembranen calcium ATPase (PMCA) ekstruderer calcium til det ekstracellulære rum, både i ATP-afhængige måder 2. Fysiologiske messengers, såsom hormoner eller neurotransmittere, sender deres signaler gennem G-protein-koblede receptorer, aktivering af phospholipase C, der hydrolyserer phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP2) i plasmamembranen at generere diacylglycerol og inositoltriphosphat (IP3) 3. Mens diacylglycerol forbliver i plasmamembranen, IP3 diffunderer ind i cytosolen og binder til IP3 receptors (IP3Rs), som ligand aktiverede calciumkanaler, fundet i ER-membranen og calcium frigives fra ER luminale butik kulminerede i en stigning i cytosoliske calciumkoncentrationer 4. En alternativ vej for calcium at nå cytosolen gennem calciumkanaler og varmevekslere til stede i plasmamembranen. Krydstale mellem disse to rum er blevet beskrevet: calcium induceret calcium frigivelse (CICR) hvor ekstracellulært calcium inducerer calcium frigivelse fra ER butikker 5, og butikken drives calcium post (SOCE) hvor tømning af ER stores registreres af STIM og forårsager åbning af Orai calciumkanaler i plasmamembranen at fremme genpåfyldning af ER-butikker 6.
Under patofysiologiske tilstande, det cellulære calcium respons er deregulerede og cytosolisk calcium stigninger i fravær af fysiologiske stimulatorer 1. Calcium reaktion kan påvirkes på en række måder: langvarig calciumsignal, forsinket calcium fjernelse fra cytosolen, udtynding af calcium butikker eller lokaliserede ændringer i calcium. Endvidere mitokondrierne tage på en central rolle i buffering og frigive calcium 7. Langvarig og / eller supramaksimal cytosolisk calcium stigning fører til celledød. Faktisk calcium er oftere end ikke er involveret i den cellulære patofysiologiske respons og er en vigtig begivenhed i en bred vifte af sygdomme, såsom neurodegenerative sygdomme, hjertesygdomme, cancer, knoglesygdom og nyresygdom, som er hovedsagelig forbundet med celledød og tab eller ændring af organ eller væv funktion 8-10. Desuden er forstyrrelse af calcium signaler er knyttet til cellulær tilpasning og ændringer i cellulære funktioner og reaktioner.
Traditionelt er calcium signaler målt med en negativt ladet fluorescerende calcium-indikator, der er lagt ind i celler i en celle-permeable acetoxymethyl (AM) ester form. Når spaltes af cellulære Esterases, forbliver fluorescerende indikatorer inden det intracellulære rum og stige i fluorescensintensitet, når calcium er bundet. Den mest kendte og anvendte calcium indikator er ratiometrisk Fura-2 er udviklet af Roger Tsien og kolleger 11. Calcium indikatorer med forskellige tilhørsforhold for calcium tillade forskellige calcium puljer, der skal overvåges. Detektionsmetoder inkluderer live-cell imaging, fluorescens mikropladeaflæser og flowcytometri. De relativt hurtige kinetik calcium signaler (normalt inden for et par sekunder til minutter) gør levende celle billeddannelse den bedste metode til at få de fleste oplysninger om karakteristika for calcium signal. Bortset fra de hurtige kinetik for calcium signaler (i millisekunder), live cell imaging er en bedre metode til at studere cellulære opdeling af calcium signalering inden for en enkelt celle 12. Absolutte calciumkoncentrationer kan beregnes ved at bestemme den minimale og maksimale fluorescens af calcium INDICATOR ved tilsætning af en calciumchelator og permeabilisering af cellerne, henholdsvis som beskrevet af Grynkiewicz et al. 11.
Anvendelse af flowcytometri til måling af calcium signaler blev først udviklet i 1980'erne i immunologiske celler, hvor muligheden for at måle flere parametre, såsom membran integritet og adskillelse af cellepopulationen, og kravet om celler i suspension kombineret med udviklingen af enkelt bølgelængde calcium indikatorer gjort flowcytometri en ideel og convenientdetection metode 13-15. I adhærente celler, live cell imaging giver den mest information om calcium signalering, vigtigst kinetikken, men kræver en kompliceret opsætning, der omfatter et fluorescens mikroskop, et perfusionssystem, opretholdelse af det cellulære miljø, såsom temperatur, og specialiseret mikroskop software til at erhverve og analyse af data. Alternative metoder, såsom et fluorescens-mikropladelæser eller Pharmacological midler gennem brug af calciumchelatorer er uforlignelig i form af indsamlede informationer. Flowcytometri bliver mere udbredt at overvåge cytosolisk calcium i adhærerende celler dog i de fleste undersøgelser, kun endepunkt målingerne er udført. Brug den metode, der oprindeligt er udviklet af Gergely et al. I immunologiske B-celler 16 har ændringer i cytosol fri calciumkoncentration ved flowcytometri med real-time kinetik og overvågning af fluorescens intensitet i de enkelte celler fra en prøve population succes blevet målt i kræft epitelceller og cancer stamceller hybrider 17. Denne fremgangsmåde blev yderligere tilpasset til anvendelse i adhærerende epitelceller, som er vanskelige at indlæse med calcium indikatorer 18.
Her, ved hjælp af en udødeliggjort klæbende epithelial cellelinie afledt fra S1 segmentet af rottenyre proximale tubulus (WKPT-0293 Cl.2) 19 beskriver vi en optimeret forenklet metode for målingen af ændringer i cytosolisk calciumkoncentration ved flowcytometri. Da mange epitelceller i besiddelse af en række organiske transportører for anioniske forbindelser kan loading af celler med en calcium-indikator vise sig at være en udfordring. For at forhindre udstrømning af calcium indikatorer, probenecid, prototypisk inhibitor af organiske anion transportører og oprindeligt udviklet til at reducere renal udskillelse af penicillin 20, påføres samtidigt i inkubationsmediet. Cellerne opretholdes i monolag for calcium indikator lastning, bringes i suspension og calcium signaler kan påvises umiddelbart efter forbindelse tilsætning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Calcium er en vigtig begivenhed i flere cellulære processer, der virker som en anden messenger signalmolekyle og også som et middel til at kommunikere mellem ER og mitokondrier. Evnen til at måle ændringer i frie cytosoliske calciumkoncentrationer er en nyttig teknik, der kan anvendes på alle områder af cellebiologi. Der er forskellige metoder til at opdage cytosoliske calcium signaler. Klassisk, signaler fra en ratiometrisk calcium-indikator, såsom Fura-2, overvåges i levende celler ved hjælp af en fluorescens…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i laboratorierne er finansieret af Fritz-Bender Foundation, München, Tyskland (TD) og en University of Witten / Herdecke interne forskningsbevilling (til W.-KL). Vi vil gerne takke Prof Dr. Dr. Frank Thévenod (Institut for Fysiologi, patofysiologi og Toksikologi, University of Witten / Herdecke) for nyttige forslag.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Fluo-3, AM | Invitrogen | F-1241 | Cell permeable |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P-8761 | Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Invitrogen | 25300-062 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| Thapsigargin | Tocris Bioscience | 1138 | |
| Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software | Becton Dickinson | ||
| Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI) | Joe Trotter, The Scripps Institute | Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data. | |
| WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line | Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH) |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium pumps in health and disease. Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Putney, J. W. Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate. Am J Physiol. 252, 149-157 (1987).
- Putney, J. W., Ribeiro, C. M. Signaling pathways between the plasma membrane and endoplasmic reticulum calcium stores. Cell Mol Life Sci. 57, 1272-1286 (2000).
- Soboloff, J., Rothberg, B. S., Madesh, M., Gill, D. L. STIM proteins: dynamic calcium signal transducers. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 549-565 (2012).
- Williams, G. S., Boyman, L., Chikando, A. C., Khairallah, R. J., Lederer, W. J. Mitochondrial calcium uptake. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10479-10486 (2013).
- Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787, 335-344 (2009).
- Monteith, G. R., Davis, F. M., Roberts-Thomson, S. J. Calcium channels and pumps in cancer: changes and consequences. J Biol Chem. 287, 31666-31673 (2012).
- Roderick, H. L., et al. Calcium in the heart: when it’s good, it’s very very good, but when it’s bad, it’s horrid. Biochem Soc Trans. 35, 957-961 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. , (2013).
- Valet, G., Raffael, A., Russmann, L. Determination of intracellular calcium in vital cells by flow-cytometry. Naturwissenschaften. 72, 600-602 (1985).
- June, C. H., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration. Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).
- Ransom, J. T., DiGiusto, D. L., Cambier, J. Flow cytometric analysis of intracellular calcium mobilization. Methods Enzymol. 141, 53-63 (1987).
- Gergely, L., Cook, L., Agnello, V. A simplified method for Ca2+ flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 4, 70-74 (1997).
- Seidel, J., et al. The neurotransmitter GABA is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1alpha induced migration of adult CD133+ hematopoietic stem and progenitor cells. Stem cells and development. 16, 827-836 (2007).
- Lee, W. K., Chakraborty, P. K., Roussa, E., Wolff, N. A., Thévenod, F. ERK1/2-dependent bestrophin-3 expression prevents ER-stress-induced cell death in renal epithelial cells by reducing CHOP. Biochim Biophys Acta. 1823, 1864-1876 (2012).
- Woost, P. G., et al. Immortalization and characterization of proximal tubule cells derived from kidneys of spontaneously hypertensive and normotensive rats. Kidney Int. 50, 125-134 (1996).
- Beyer, K. H., et al. Benemid,’ p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; its renal affinity and its elimination. Am J Physiol. 166, 625-640 (1951).
- Buckley, B. J., Whorton, A. R. Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells. Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).
- Koepsell, H. The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions. Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).
- Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).
- Brezden, C. B., Hedley, D. W., Rauth, A. M. Constitutive expression of P-glycoprotein as a determinant of loading with fluorescent calcium probes. Cytometry. 17, 343-348 (1994).
- Thévenod, F., Friedmann, J. M., Katsen, A. D., Hauser, I. A. Up-regulation of multidrug resistance P-glycoprotein via nuclear factor-kappaB activation protects kidney proximal tubule cells from cadmium- and reactive oxygen species-induced apoptosis. J Biol Chem. 275, 1887-1896 (2000).
- Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A., Thévenod, F. Cadmium induces Wnt signaling to upregulate proliferation and survival genes in sub-confluent kidney proximal tubule cells. Mol Cancer. 9, 102 (2010).
- Jennings, L. K., Dockter, M. E., Wall, C. D., Fox, C. F., Kennedy, D. M. Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry. Blood. 74, 2674-2680 (1989).
- Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM. Cytometry. 10, 165-173 (1989).
