הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת
Summary
Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.
Abstract
עם קצב התקדמות מדע בהאצה במהירות, שיטות חדשות יש צורך למדעי מוח ניסיוני לתמרן במהירות ובקלות ביטוי גנים במוח העכבר. כאן אנו מתארים טכניקה הוצגה לראשונה על ידי Passini ווולף למסירה תוך גולגולתי ישירה של transgenes באופן ויראלי בקידוד לתוך מוח העכבר בילוד. בצורתו הבסיסית ביותר שלה, ההליך דורש רק דלי קרח ומזרק microliter. עם זאת, הפרוטוקול יכול גם להיות מותאם לשימוש עם מסגרות stereotaxic כדי לשפר את העקביות לחוקרים חדשים לטכניקה. השיטה מסתמכת על יכולתו של נגיף Adeno הקשורים (AAV) לנוע בחופשיות מחדרי הלב המוחי לparenchyma המוח בזמן שבטנת ependymal היא עדיין לא בשלה במהלך 12-24 לשעה הראשונה שלאחר לידה. הזרקה תוך חדרים של AAV בתוצאות בגיל זה בתמרה נרחבת של תאי עצב במוח. ביטוי מתחיל בתוך ימים של הזרקה ונמשך lifetimדואר של בעלי החיים. כייל נגיף יכול להיות מותאם כדי לשלוט בצפיפות של נוירונים transduced, תוך שיתוף ביטוי של חלבון פלואורסצנטי מספק תווית חיונית של תאי transduced. עם הזמינות העולה של מתקני גרעין נגיפיים לספק חומרים כימיים שני, ארוזים מראש מחוץ למדף והכנה נגיפית מותאם אישית, גישה זו מציעה בזמן שיטה לטיפול בביטוי גנים במוח העכבר שהוא מהיר, קל, והרבה פחות יקר מ הנדסה בתאי מין מסורתית.
Introduction
שיטות מסורתיות לשינוי ביטוי גנים עצבי דורשות זמן רב ומניפולציות בתאי מין יקרות. אלטרנטיבי דה נובו גישות כגון electroporation ברחם או הזרקת lentiviral stereotaxic להניב תוצאות מהירות יותר ופחות יקרים, אבל יש לי החסרון של צורך בהתערבות כירורגית מורכבת 1-3. יתר על כן, יש ביטוי transgene מגוון מרחבי מוגבל עם שיטות אלה. בזאת, אנו מתארים שיטה מהירה, קלה, וחסכונית למניפולציה עצבית נרחבת באמצעות הזרקה תוך חדרים של נגיף Adeno הקשורים (AAV) לתוך מוח העכבר בילוד. השיטה תוארה לראשונה על ידי ג'ון וולף ומרקו Passini ב2001, שבו הם הציעו גודל חלקיקים קטן של AAV אפשר לה לפזר בתוך נוזל השדרה מוחין כשהוא עובר מחדרים לרוחב דרך מחסום ependymal לא בשלה ולתוך parenchyma המוח 4, 5. הזרקה תוך חדרים של AAV בתוך first 24 שעות לאחר תשואות לידת התמרה ויראלית נרחבת של תת עצביים הכולל את כל אזור של המוח, מנורות חוש הריח לגזע המוח 6,7. transgenes נמסר-באופן ויראלי בא לידי ביטוי ופעיל בתוך ימים של הזרקה ולהימשך עד שנה לאחר התמרה. לפיכך, מניפולציה תכליתית זה מאפשרת לימודים החל מהתפתחות המוח לאחר לידה מוקדמת להזדקנות וניוון במבוגרים.
בהתאמת הטכניקה לצרכי הניסוי הספציפי שלנו, יש לנו התמקדנו בעיקר בserotype AAV8 כי זה הוא יעיל ביותר בtransducing תאי עצב 6. אנו מראים כי כייל נגיף יכול להיות מדוללים כדי לשלוט בצפיפות של נוירונים transduced להשלכות תא פנימי לבדיקת ניסויים של מניפולציה גנטית. בנוסף, אנו מראים כי שני וירוסים יכולים להיות שותף הזריקו לייצר דפוסי ביטוי שמוטים כלפי קבוצות שונות או חופפות של תאי עצב, בהתאם לזנים אל נבחרו לאריזת ויראלי. העבודה שלנו מרחיבה את הרבגוניות של טכניקה זו לשימוש במגוון רחב של הגדרות מדעי מוח ניסיוני.
Protocol
Representative Results
Discussion
שתארנו הליך תכליתי עבור המניפולציה ביטוי גנים עצבי באמצעות AAV ככלי למסירה נרחבת למוח העכבר בילוד. בהשוואה לשיטות אחרות של transgenesis העצבי כגון electroporation ברחם 1 או הזרקה תוך גולגולתי stereotaxic 2,3, הזרקה נגיפית בילוד היא קלה ופשוט יחסית. ההליך הבסיסי יכול להתבצע בתו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Robert A. and Rene E. Belfer Family Foundation, NIA R21 AG038856 (JLJ), BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease research grant A2010097 (JLJ), and NIA Biology of Aging Training grant T32 AG000183 (support for SDG).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ICR outbred mice | Harlan | Hsd:ICR (CD-1) | This strain is also known as CD-1 |
| FVB inbred mice | The Jackson Laboratory | 1800 | 5-6 weeks of age |
| Nestlets | Lab Supply | NESTLETS | |
| Shepherd shacks | Lab Supply | SS-mouse | |
| High fat rodent chow | Purina Mills | PicoLab Mouse diet 20, #5058 | This is our standard breeder chow |
| High fat rodent chow (alternative) | Harlan Laboratories | Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S | If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed |
| Injection syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 ml syringe |
| Injection needles | Hamilton | 7803-04, RN 6PK PT4 | 32 gauge, for standard P0 injections |
| Metal plate for cryoanesthesia | McMaster Carr | 8975K439 | Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop |
| Small animal stereotaxic device with digital readout | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Universal syringe holder with needle support foot | David Kopf Instruments | Model 1772-F1 | |
| Neonatal frame | Stoelting | 51625 | Officially called a mouse and neonatal rat adaptor |
| Biohazard disposal bags with sterile indicator | VWR | 14220-030 | Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal |
References
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Progress in neurobiology. 92, 227-244 (2010).
- Sun, B., Gan, L. Manipulation of gene expression in the central nervous system with lentiviral vectors. Methods Mol Biol. 670, 155-168 (2011).
- Puntel, M., et al. Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors. Curr Protoc Neurosci. 4, (2010).
- Passini, M. A., Wolfe, J. H. Widespread gene delivery and structure-specific patterns of expression in the brain after intraventricular injections of neonatal mice with an adeno-associated virus vector. J Virol. 75, 12382-12392 (2001).
- Passini, M. A., et al. Intraventricular brain injection of adeno-associated virus type 1 (AAV1) in neonatal mice results in complementary patterns of neuronal transduction to AAV2 and total long-term correction of storage lesions in the brains of beta-glucuronidase-deficient mice. J Virol. 77, 7034-7040 (2003).
- Kim, J. Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur J Neurosci. 37, 1203-1220 (2013).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PloS one. 8, (2013).
- Croyle, M. A., Cheng, X., Wilson, J. M. Development of formulations that enhance physical stability of viral vectors for gene therapy. Gene therapy. 8, 1281-1290 (2001).
- Bauer, H. C., Bauer, H. Neural induction of the blood-brain barrier: still an enigma. Cellular and molecular neurobiology. 20, 13-28 (2000).
- Cearley, C. N., et al. Expanded repertoire of AAV vector serotypes mediate unique patterns of transduction in mouse brain. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1710-1718 (2008).
- Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J Virol. 82, 5887-5911 (2008).
