Sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína
Summary
Utilizando microarrays de proteína que contêm quase toda a S. cerevisiae proteoma é sondado para um rápido interrogatório imparcial de milhares de interações proteína-proteína em paralelo. Este método pode ser utilizado para a molécula de proteína-pequena, a modificação pós-traducional, e outros ensaios in high-throughput.
Abstract
Microarrays proteicos funcionais de alta densidade contendo ~ 4200 proteínas de levedura recombinantes são examinados para interacções proteína-proteína-quinase, utilizando uma proteína de fusão purificada por afinidade, de levedura de quinase contendo uma etiqueta de epitopo-V5 para read-out. Quinase purificada é obtida através da cultura de uma estirpe de levedura optimizado para a produção de proteínas de cópias elevado contendo um plasmídeo contendo uma fusão de quinase-V5 construir sob um promotor GAL indutível. A levedura é cultivada em meios restritiva com uma fonte de carbono neutro durante 6 horas, seguido por indução com galactose a 2%. Em seguida, a cultura é colhida e quinase é purificado usando técnicas cromatográficas padrão de afinidade para se obter uma proteína-quinase de elevada pureza para utilização no ensaio. A quinase purificada é diluída com tampão de quinase de um conjunto adequado para o ensaio e os microarrays da proteína estão bloqueados antes da hibridação com o microarray da proteína. Após a hibridação, as matrizes são sondados com V5 monoclonal ANTIBody para identificar proteínas ligadas pela proteína cinase-V5. Finalmente, as matrizes são digitalizados utilizando um scanner de microarray padrão, e os dados são extraídos para a análise informática jusante 1,2 para determinar uma confiança elevada conjunto de interacções de proteínas a jusante para validação in vivo.
Introduction
A necessidade de se realizar análises globais de bioquímica de proteínas e actividade in vivo de ligação resultou no desenvolvimento de novos métodos para perfilar as interacções proteína-proteína (IBP) e as modificações pós-traducionais de proteomas inteiros 1,3-8. Microarrays da proteína são fabricados como microarrays funcionais de proteínas utilizando proteínas funcionais full-length 4-6,8,9, ou microarrays da proteína analíticas contendo anticorpos 10,11. Eles foram concebidos para conter uma elevada densidade de proteínas dispostas em lâminas de microscópio com uma variedade de químicas de superfície para facilitar uma variedade de condições experimentais necessários para a realização de uma ampla análises bioquímicas 12. Nitrocelulose e de superfície aldeído químicas para fixação química através de métodos de lisina ou de fixação de afinidade, tais como lâminas de quelatos de níquel para a fixação de proteínas His-tag e glutationa para fixação afinidade entre outros 13. </p>
A utilização de microarranjos de proteínas funcionais para detectar interacções proteína-proteína requer acesso a uma biblioteca de proteínas de alta qualidade funcional 14. S. cerevisiae é favorável à produção de uma tal biblioteca através do emparelhamento de afinidade de elevada cópia etiquetados com construções de proteínas de alto rendimento técnicas de purificação cromatográfica. A grande maioria do genoma da levedura foi sequenciado e quase todo o proteoma pode ser expresso a partir de um plasmídeo de elevado número de cópias para a purificação e análises bioquímicas 12. Uma vez que as proteínas são obtidas e dispostos em formato de 384 poços, eles são impressas em uma lâmina de microscópio permitindo a análise bioquímica rápida paralelo multi-paramétricos e interrogatório bioinformática 8,14-16. Protein microarrays foram utilizadas para ensaios enzimáticos e interacções com proteínas, lípidos, moléculas pequenas, e ácidos nucleicos, entre muitas outras aplicações. A acessibilidade de proteínas na superfície de proteomamatrizes de torná-los passíveis de diferentes tipos de detecção analítica, incluindo imuno-afinidade, Surface Plasmon Resonance, fluorescência e muitas outras técnicas. Além disso, permite o controle preciso da condição experimental, onde ele pode ser difícil de fazer in vivo.
O objectivo deste protocolo é para demonstrar o uso apropriado de microarrays de proteína funcionais para detectar interacções proteína-proteína. Esta aplicação permite a análise bioquímica paralela de alta taxa de transferência de actividades de ligação de proteínas utilizando uma substância altamente purificado (proteína) de interesse. Um C-terminal (C-terminal) com a etiqueta de proteína isco V5-fusão de interesse é produzida a partir de um plasmídeo de elevado número de cópias numa estirpe de levedura optimizado para a purificação de proteínas. Marcação de C-terminal assegura que a proteína de comprimento completo foi traduzido. A proteína utilizada no presente estudo é Tda1-V5 proteína de fusão de cinase, que é purificado utilizando resina de afinidade de níquel através de uma marcação His6X. A construç fusão Tda1-V5t é purificado através de eluição em série, utilizando um gradiente de imidazole para eluir a fracção mais altamente enriquecida para uso no ensaio.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo apresentado foi inicialmente realizada usando 85 proteínas de fusão de cinase-V5 únicas proteínas de levedura para comparar a actividade de ligação entre as famílias distintas e relacionadas de proteína-quinases de levedura, resultando na identificação de novas redes de interacção quinase in vivo 1. Como uma tecnologia de criação de perfil proteômica emergentes, o desenvolvimento de Alto Rendimento (HTP) rastreio de proteomas usando microarrays da proteína contavam com bib…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the NIH. The assays shown in Figure 1 was performed by Dr. Joseph Fasolo. We thank Dr. Rui Chen for helpful comments.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Petri Dishes | VWR | NC-10747 | or comparable |
| Bacto yeast extract | Difco | 0217-17 | |
| Bacto peptone | Difco | 0118-17 | |
| Bacto agar | Difco | 0140-01 | |
| Dextrose | Sigma | D9434 | |
| Raffinose | Sigma | R0514 | |
| Galactose | Sigma | G0750 | |
| Sc-Ura drop out media | MP Bio | 114410622 | |
| Small Culture tubes | VWR/Fisher | ||
| Large Erlenmeyer Flask | VWR/Fisher | ||
| Centrifuge JA-10 rotor | |||
| Centrifuge tubes (500 mL) | |||
| Falcon tube (50 mL) | VWR/Fisher | 21008-951 | |
| PBS Tablets | Sigma | P4417 | |
| FastPrep Tubes(2ml screw cap tube) | |||
| FastPrep Machine | MP Biomedicals | 116004500 | |
| Zircon Beads | BioSpec | 11079105 | |
| Triton X100 | Sigma | P4417 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| Imidazole (pH = 7.4) | Sigma | I5513 | |
| PMSF | Sigma | 93482 | |
| Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free) | Roche | 11873580001 | |
| Phosphatase inhibitor cocktail 1 | sigma | P2850 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| ATP | Sigma | A1852 | |
| Shaking Incubator (30 °C) | |||
| Nickel Affinity Resin | Life Technologies | R901-01 | |
| G25 column | GE life sciences | 27-5325-01 | |
| Nutator | VWR/Fisher | ||
| SDS-PAGE Gel (NuPage) | Life Technologies | ||
| Coomassie Blue Stain | Life Technologies | ||
| Monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | R960-25 | |
| Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody | Life Technologies | 451098 | |
| Protein Microarrays Kit | Life Technologies | PAH0525013 | |
| Genepix Scanner | Molecular Devices | ||
| Lifter Slips | Thomas Scientific | http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/ | |
| Lysis Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) |
Add the reagents to 1 X PBS (0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, 0.137 M sodium chloride; pH 7.4) to obtain the desired volume of lysis solution | ||
| Blocking Buffer: 1% bovine serum albumin (BSA), 0.1% Tween-20 | Add the reagents to 1 X PBS to obtain the desired volume of blocking buffer | ||
| Probe Buffer: 2 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.05% Triton X-100, 50 mM NaCl,500 μM ATP (for kinases), 1% BSA | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Wash Buffer: 0.1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 50 mM imidazole (pH 7.4),2 mM MgCl2 | Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| Elution Buffer: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 – 500 mM imidazole (pH 7.4), Complete protease inhibitor cocktail – EDTA-free, Phosphatase inhibitor Cocktail 1, 1 mM PMSF (add just prior to use) | Before you begin, it is important to note the concentration gradient of imidazole (50 – 500 mM) and to create separate tubes for each concentration (it is advisable to create the interval using 50 mM increments). Add the reagent to 1 X PBS to obtain desired volume of probe buffer | ||
| 3x YEP +6% galactose: Dissolve 30 g of yeast extract and 60 g of peptone in 700 ml of H2O, and autoclave. Add 300 ml of filter sterilized 20% galactose (wt/vol) | galactose should not be autoclaved |
References
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