Новый метод для локализации Reporter флуоресцентные шарики Ближних культуре клеток для увеличения силы сцепления силовой микроскопии
Summary
Традиционные методы изготовления полиакриламид (PA) гели, содержащие флуоресцентных зондов включают прослаивая гель между примыкающей поверхности и стекло. Здесь мы показываем, что покрытия этот слайд с поли-D-лизина (PDL) и флуоресцентных зондов локализуется зондов с точностью 1,6 мкм от поверхности геля.
Abstract
PA гели уже давно используются в качестве платформы для изучения клеток силы тяги, благодаря простоте изготовления и возможность настроить свои эластичные свойства. Когда подложка покрыта белком внеклеточного матрикса, клетки придерживаться геля и применять силы, в результате чего гель деформироваться. Деформация зависит от клеточного тяги и упругих свойств геля. Если поле деформация поверхности, как известно, поверхность тяги может быть рассчитана с использованием теории упругости. Гель деформации обычно измеряется путем встраивания флуоресцентным маркером шарики равномерно в гель. Зонды вытеснить как гель деформируется. Зонды вблизи поверхности геля отслеживаются. Смещения, о которых сообщают эти зонды считаются смещений поверхности. Их глубины от поверхности игнорируются. Это предположение вводит ошибку в оценках силы тяги. Для точного измерения клеточных сил, она имеет решающее значение для расположения бусинок, чтобы быть известным. Мы разработалитехника, которая использует простой химию ограничиться флуоресцентные бусы маркеров, 0,1 и 1 мкм в диаметре, в ПА гелей, в 1,6 мкм от поверхности. Мы пальто покровное с поли-D-лизина (PDL) и люминесцентных бисером. Раствор геля ПА затем зажата между покровным и примыкающей поверхности. Флуоресцентные шарики передать в растворе во время затвердевания геля. После полимеризации гель PA содержит флуоресцентные бусы на плоской близко к поверхности геля.
Introduction
Механическое взаимодействие живой клетке с местной окружающей среды имеет обычно были изучены с помощью PA гели. Эти субстраты полагаться на простой, хорошо характеризуется протоколом, принятым Дембо и Ван в 1997 году 1. Одним из основных преимуществ этих субстратов является то, что их жесткость может быть настроена путем изменения концентрации специфических компонентов раствора геля. Это обеспечивает желаемый платформу для изучения взаимодействия клеток с средах различной жесткостью. Когда PA гели покрыты внеклеточного матрикса (ECM) белков, клетки их придерживаться, создавая силу. В результате клетки силы, гель деформируется как упругое тело. Эта деформация зависит от величины силы, приложенной клетками и упругих свойств геля. В разных работах использовались PA гели для расследования клеточные силы тяги.
В одном из вариантов изготовления геля Звуковая, флуоресцентные микросферы (бисер) встроены тhroughout гель для количественного клеток тяговые силы на гелях различной жесткостью 2. По заявлению клеток силы, шарики вытеснить из исходного местоположения следующей деформации геля. Поле деформация измеряется от отдельных смещений бортов. Это поле деформации используется с теории упругости и упругих свойств геля для вычисления силы тяги. Эти измерения дают представление о том, как клетки механически чувствовать и взаимодействовать с их микроокружения 3.
Во многих широко используемых ПА изготовления геля протоколов, шарики перемешаны по всему геля ООПТ в жидком, неполимеризованного государства. Полностью полимеризованный ПА гель содержит флуоресцентные шарики по всему объему. При вычислении клеток тяговые силы, бусы большинство вблизи поверхности геля (интерфейс клеток-подложка) контролируются. Смещения этих шариков, как предполагается, возникает на поверхности клеточной культуры для простоты в силовом calculatioн. Фактическое расположение шариков в пределах глубины геля не учитывается. Тем не менее, в упругой среде (например, PA гель), шарик ближе к точке приложения силы перемещается больше, чем шарик, который дальше от точки. Таким образом, лечение смещение точки (по месту нахождения борта) дальше от поверхности, что и на поверхности приводит к недооценке сотовых тяг. Степень погрешности зависит от расстояния борта из поверхности. Ошибка не может быть оценена без ведома расположения шарика.
Необходимость в простом способе ограничиться бусы очень близко к поверхности клеточной культуры была решена на несколько приемов. Один путь состоит в том, чтобы увеличить плотность шариков по всей гель таким образом, что имеется достаточное количество шариков в верхней фокальной плоскости для измерения движения в непосредственной близости от поверхности. Другой метод предусматривает строительство конфокальной изображения камеры для получения изображений живых клеток таким образом, что свет оттолько бусы в верхнем наиболее фокальной плоскости собираются 4. Другой метод предполагает наложение чрезвычайно тонкий слой Звуковая геля, содержащего бусы поверх уже полимеризованном геля без шариков 5. Недостатком каждого из этих методов в том, что точное местоположение шариков в геле не известно. Это вносит ошибку в расчете поля смещения гранул, и, таким образом, при расчете клеток сил. Другой способ включает сопряжение из бисера на верхней поверхности уже полимеризуется Звуковая геля с использованием сульфо-SANPAH 6. Эта методика обеспечивает шарики действительно только на верхней части геля PA, но степень, в которой они включены в глубине геля неизвестно. Потенциально это может создать локальную топографию для клеток, которые могут изменить поведение клеток, как до работы предположил, что клетки могут ощутить силы несколько микрон Гости 7. Недавно, техника для рисунка PA гели с диаметром 1 мкм фluorescent фибронектин точечные маркеры в регуляризированной массива была создана 8. В этом случае глубина флуоресцентных маркеров, как известно, и, по существу, равен нулю, так как картина фибронектин косвенно напечатан на поверхности геля. Однако этот способ не обеспечивает непрерывную среду, на которой клетки могут приложить, как белок ЕСМ ограничен точками диаметром 1 мкм. Способ полной интеграции трекер бусы в ПА гелей и ограничивая их в известном месте в непосредственной близости от поверхности до сих пор не установлено.
Здесь мы разработать методику, чтобы ограничить суб-мкм до диаметра мкм флуоресцентные шарики в фокальной плоскости очень близко к поверхности клеточной культуры в ПА геля. Гель обычно отверждают с помощью сэндвич Неполимеризованные раствор жидкий гель между двумя стеклянными пластинами. Одна из пластин функционализированные таким образом, что гель сильно прилипает к ней. Другой нефункционализованного и удаляется после гель лечения. Мы изменить этот съемный стакан всrface покрытием его слоем шариков. После сэндвич жидкий гель между функционализированного и бортового покрытием поверхности стекла, передача шарики с гелем, пока он отверждения. Это ограничивает расстояние интеграции шарики "в гель в течение 1,6 мкм от поверхности. Блюда с прозрачным дном Петри используются в качестве адгезивного поверхности, на которой гель отвержденной. Чтобы сформировать плоскую верхнюю поверхность геля при полимеризации, круговая скольжения стеклянная крышка используется для сэндвич гель с стеклянным дном чашки Петри. Перед изготовлением гель, сверху покровным стеклом покрывают поли-D-лизина (PDL), что дает положительный поверхностный заряд. PDL сдувается сжатым воздухом, и раствор шариков в воде, осаждается на покровных стеклах. Мы используем карбоксилированные флуоресцентные микрошарики, которые несут отрицательный заряд, и взаимодействовать с положительно заряженной поверхности, образованной путем обработки PDL. После продувки борта решение от покровного стекла сжатым воздухом, одного слоябусины остается электростатически соединен с сухим покровным стеклом. PDL покрытие не влияет на адгезию стекла к поверхности геля, как стеклышки не повреждены и удалены от ПА геля полностью нетронутыми.
Стеклянные дном чашки Петри изготовлены прилипший путем обработки 97% 3-аминопропил-trimethoxysliane и 0,5% глутарового альдегида. PA гели желаемых жесткости создаются путем смешивания соответствующих концентраций бис-акриламида и акриламида с помощью стандартной процедуры 9. Каплю раствора гель наноситс пипеткой на стеклянным дном чашки Петри. Скольжения стеклянная крышка, содержащий бусинки используется для сэндвич гель с чашки Петри. Когда гель отверждается, в верхней покровное стекло удаляется оставив шариков, погруженных в геле PA пределах 1,6 мкм от поверхности.
Protocol
Representative Results
Discussion
При использовании этого метода, важно, чтобы раствор шарик образом разводили и гранулы выбраны на основании желаемого диаметра, Пенсильвания гелевой основе жесткость, а размер шкалы явлений, которые исследовали в нужном эксперимента.
Внимание должно быть принято при р?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить инициативы программы Междисциплинарный Инновации, Университет штата Иллинойс, грант 12035. SK финансировалась на UIUC от Национального научного фонда (NSF) Грант 0965918 IGERT: подготовки следующего поколения исследователей в клеточной и молекулярной механики и Бионанотехнология.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Reagents | ||
| 97% 3-Aminopropyl-trimethoxysliane (APTES) | Sigma-Aldrich | 281778 |
| 70% Glutaraldehyde | Polysciences, Inc. | 111-30-8 |
| 1M HEPES buffer solution | Sigma-Aldrich | 83264 |
| 40% Acrylamide | Sigma-Aldrich | A4058 |
| 2% Bisacrylamide | Sigma-Aldrich | M1533 |
| 0.1 um Fluorescent microspheres (mCherry) | Invitrogen | F8801 |
| Fibronectin, Human, 1mg | BD Biosciences | 354008 |
| Ammonium Persulfate | Bio-RAD | 161-0700 |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-RAD | 161-0801 |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E |
| 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific | 22980 |
| N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 |
| .05% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25300-054 |
| NaCL | Sigma-Aldrich | S9888 |
| Acrylic Acid | Sigma-Aldrich | 147230 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7757 |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 |
| Materials | ||
| 35 mm Glass bottom dish with 14 mm micro-well #1 cover glass | In Vitro Scientific | D35-14-1-N |
| Glass cover slips, 12 mm diam. | Ted Pella, Inc. | 26023 |
References
- Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. PNAS. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophys. J. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophys. J. 79 (1), 144-152 (2000).
- Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction. JoVE. , (2010).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide Hydrogels for Cell Mechanics: Steps Toward Optimization and Alternative Uses. Methods in Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
- Marinkovic, A., Mih, J. D., Park, J. -. A., Liu, F., Tschumperlin, D. J. Improved throughput traction microscopy reveals pivotal role for matrix stiffness in fibroblast contractility and TGF-β responsiveness. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 303 (3), 169-180 (2012).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E. X., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. J. Phys.: Condens. Matter. 22 (2010), 194116-194126 (2010).
- Polio, S. R., Rothenberg, K. E., Stamenovic, M. L., Smith, A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8, 82-88 (2012).
- Wang, Y. L., Pelham, R. J. Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells. Methods in Enzymol. 298, 489-496 (1998).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biol. , 16 (2010).
- Poellmann, M. J., Wagoner Johnson, A. J. Characterizing and Patterning Polyacrylamide Substrates Functionalized with N-Hydroxysuccinimide. Cell and Mol. Bioengineering. 6 (3), 299-309 (2013).
- Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., Deshiere, A., Balland, M., Guillou, H., Filhol, O., Théry, M. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell–cell junction positioning. PNAS. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Trappmann, B., Gautrot, J. E., Connelly, J. T., Strange, D. G. T., Li, Y., Oyen, M. L., Cohen Stuart, M. A., Boehm, H., Li, B., Vogel, V., Spatz, J. P., Watt, F. M., Huck, W. T. S. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. Nature Materials. 11, 642-649 (2012).
- Wong, J. Y., Leach, J. B., Brown, X. Q. Balance of chemistry, topography, and mechanics at the cell-biomaterial interface: Issues and challenges for assessing the role of substrate mechanics on cell response. Surface Science. 570 (1-2), 119-133 (2004).
- Mih, J. D., Sharif, A. S., Marinković, A., Symer, M. M., Tschumperlin, D. J. A Multiwell Platform for Studying Stiffness-Dependent Cell Biology. PLoS ONE. 6 (5), e19929 (2011).
- Butler, J. P., Tolić-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. Am J Physiol Cell Physiol. 282, 595-605 (2001).
- Tolić-Nørrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. Am J Physiol Cell Physiol. 283, 1254-1266 (2002).
- Atanackovic, T., Guran, A. . Theory of Elasticity for Scientists and Engineers. , (2000).
