Usando a sobreposição de ensaio para medir qualitativamente produção bacteriana e sensibilidade para pneumocócica Bacteriocinas
Summary
Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species. Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.
Abstract
Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.
Introduction
Streptococcus pneumoniae, um colonizador comum da comunidade polimicrobiana da nasofaringe, é capaz de competir com outros pneumococos e espécies estreitamente relacionadas com a produção de peptídeos antimicrobianos produzidos por bactérias (bacteriocinas). Cada cepa de pneumococo totalmente sequenciado examinado até o momento contém uma versão do b acteriocin- l ike lócus p eptide, blp. Produção de bacteriocina por pneumococos foi demonstrada ser importante no resultado de estudos in vitro e in vivo em competição 1-4. Dinâmica competitiva são influenciados pela expressão de diversas proteínas de bacteriocinas, juntamente com imunidade cognatos em resposta a uma feromona de péptido específico. Indução do locus blp é controlada por um sistema de sensor de quorum na qual um péptido de feromonas, BLPC, liga-se ao sensor de quinase, BlpH, e inicia uma cascata de sinalização que resulta em otranscrição do locus de 5,6 blp. Existem quatro variantes alélicas BLPC que se ligam a cada um o seu cognato BlpH 6. Para a célula sobreviver os efeitos da sua própria bacteriocina, os genes que codificam as proteínas cognatas imunidade são transcritos no mesmo operão como cada um dos genes de bacteriocina. Matar ocorre se uma estirpe de competidor não é capaz de regular positivamente o locus blp em resposta a feromona exógena ou, se a estirpe não tem o gene da imunidade específica é necessária para a protecção. O complexo transportador, BlpAB é necessário para a secreção e processamento do péptido de feromona e dos péptidos de bacteriocina 2,4. Recentemente, tem sido demonstrado que uma proporção significativa de cepas de pneumococo são "trapaceiros", que significa que eles têm uma mutação no gene conservado BLPA que os torna incapazes de secretar feromônios e bacteriocinas 1,2. Essas cepas são capazes de responder a BLPC exógena 2 secretado pelo relincharestirpes chatas que permitem a produção de proteínas de imunidade.
Embora, preparações cruas de bacteriocinas de sobrenadantes podem ser preparados a partir de estirpes produtoras utilizando métodos bioquímicos passos para alcançar a pureza, esta abordagem não é útil para o rastreio de grandes colecções de isolados e, se o nível de expressão é baixo bacteriocina em caldo de culturas cultivadas 2,7- 9. O ensaio de sobreposição é usada como uma forma rápida para investigar a dinâmica da concorrência entre as linhagens que podem existir in vitro. Para isso, uma estirpe de pneumococos é pré-inoculado em uma placa de agar e deixadas a crescer até atingir concentrações bacterianas locais suficientes para a indução do locus blp. Uma segunda estirpe é inoculada em seguida uma solução de agar mole fundido, que é então aplicada sobre a tensão pré-inoculado para testar a sensibilidade. Para avaliar a actividade do locus blp (independente da actividade inibidora), as estirpes podem ser cobertos com uma série de three linhagens descritas anteriormente repórter BLPC. Essas linhagens foram construídos para conter um dos três alelos blpH diferentes que respondem a três feromônios BLPC mais comuns secretados pelo pneumococo. As estirpes de repórter tem um gene lacZ integrada, que está sob o controlo de um promotor dependente BlpH e transportar uma deleção no gene BLPC que impede a auto-estimulação 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este ensaio sobreposição é uma maneira rápida para determinar o leque de actividades para os produtores de bacteriocinas e demonstrar interações competitivas que podem ocorrer entre cepas de pneumococo. O ensaio de sobreposição pode ser adaptado para ser usado para o rastreio de várias estirpes de produção de bacteriocina, numa única placa. Temos rastreados com sucesso de grandes colecções de deformação com este ensaio, utilizando um replicador de 48 pinos para inocular placas de SBA de uma metade de uma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by Elizabeth E. Kennedy Research Award.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH20 autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH20 autoclave |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
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