Att mäta flöden av mineralnäringsämnen och gifter i Växter med radioaktiva markörer
Summary
In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.
Abstract
Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.
Introduction
Upptaget och distribution av näringsämnen och gifter påverkar starkt växtligheten. Följaktligen utredning av underliggande transportprocesser utgör ett stort forskningsområde inom växtbiologi och jordbruksvetenskap 1,2, särskilt i sammanhang av näringsoptimering och miljöstress (t.ex. salt stress, ammonium toxicitet). Främst bland metoder för mätning av flöden i växter är användningen av radioisotopspårämnen, som utvecklats kraftigt under 1950-talet (se t ex 3) och fortsätter att vara i stor utsträckning idag. Andra metoder, såsom mätning av näringsutarmning från roten medellång och / eller ackumulering i vävnader, användningen av jonselektiva vibrerande mikroelektroder såsom MIFE (mikroelektrod jonflödet uppskattning) och Siet (scanning jonselektiv elektrod teknik), och användning av jonselektiva fluorescerande färgämnen, är också i stor utsträckning, men är begränsade i sin förmåga att detektera netto influensaxes (dvs skillnaden mellan inflöde och utflöde). Användningen av radioisotoper, å andra sidan, gör forskaren en unik förmåga att isolera och kvantifiera enkelriktade flöden, som kan användas för att lösa kinetiska parametrar (t.ex. K M och V max), och ge insikt i kapaciteten, energetik, mekanismer och reglering, för transportsystem. Enkelriktade flödesmätningar gjorda med radiospårämnen är särskilt användbara under förhållanden där flödet i motsatt riktning är hög, och omsättningen av intracellulära pooler är snabb 4. Dessutom radiospårmetoder tillåter mätningar som ska genomföras under relativt höga substratkoncentrationer, till skillnad från många andra tekniker (se "Diskussion", nedan), eftersom den spårade isotopen observeras mot en bakgrund av en annan isotop av samma element.
Här ger vi detaljerade steg för radioisotop mätning av enkelriktad och net flöden av mineralnäringsämnen och gifter i intakta växter. Tonvikten kommer att göras på flödesmätning av kalium (K +), en växt macronutrient 5, och ammoniak / ammonium (NH3 / NH4 +), en annan macronutrient som dock giftiga om närvarande vid höga koncentrationer (t.ex., 1 10 mM) 2. Vi kommer att använda radioisotoper 42 K + (t 1/2 = 12,36 tim) och 13 NH 3/13 NH 4 + (t 1/2 = 9,98 min), respektive, i intakta plantor av modellsystemet korn (Hordeum vulgare L .), i beskrivningen av två viktiga protokoll: direkta inflödet (DI) och kompartmentanalys med spår utflöde (CATE). Vi bör notera från början att den här artikeln beskrivs bara de åtgärder som krävs för att utföra varje protokoll. Vid behov är korta beskrivningar av beräkningar och teori som, men detaljerade utläggningar om varje teknikS bakgrund och teori kan hittas i flera viktiga artiklar i ämnet 4,6-9. Viktigt är dessa protokoll är i stort sett överföras till flussmedel analys av andra näringsämnen / toxiska ämnen (t.ex. 24 Na +, 22 Na +, 86 Rb +, 13 NO 3 -) och andra växtarter, om än med några varningar (se nedan) . Vi betonar också vikten av att alla forskare som arbetar med radioaktivt material måste arbeta under en licens ordnas genom deras institutions joniserande strålning säkerhetsmyndigheten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som visas i exemplen ovan, är den radioaktiva spårmetod ett kraftfullt medel för att mäta enkelriktade flöden av näringsämnen och gifter i planta. Figur 1 visar att NH3 tillströmning kan nå högre än 225 mikromol g -1 tim -1, som kanske är det högsta bona fide trans flux någonsin rapporterats i en växtsystemet 13, men omfattningen av detta flöde skulle inte vara synlig om endast nettoflöden mättes. Detta beror på att ett sto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), the Canada Research Chair (CRC) program, and the Canadian Foundation for Innovation (CFI).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400-mL glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1-mL pipette | Gilson | F144493 | |
| 10-mL pipette | Gilson | F144494 | |
| 1-mL pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10-mL pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
References
- Kronzucker, H. J., Coskun, D., Schulze, L. M., Wong, J. R., Britto, D. T. Sodium as nutrient and toxicant. Plant Soil. 369, 1-23 (2013).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. NH4+ toxicity in higher plants: a critical review. J. Plant Physiol. 159, 567-584 (2002).
- Epstein, E. Mechanism of ion absorption by roots. Nature. 171, 83-84 (1953).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Can unidirectional influx be measured in higher plants? A mathematical approach using parameters from efflux analysis. New Phytol. 150, 37-47 (2001).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Cellular mechanisms of potassium transport in plants. Physiol. Plant. 133, 637-650 (2008).
- Walker, N. A., Pitman, M. G., Lüttge, U., >Pitman, M. .. G. Measurement of fluxes across membranes. Encyclopedia of plant physiology. 2 Part A, (1976).
- Kronzucker, H. J., Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M. Analysis of 13NH4+ efflux in spruce roots – A test case for phase identification in compartmental analysis. Plant Physiol. 109, 481-490 (1995).
- Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M., Ruth, T. J. Studies of the uptake of nitrate in barley. 3. Compartmentation of NO3-. J. Exp. Bot. 42, 1455-1463 (1991).
- Lee, R. B., Clarkson, D. T. Nitrogen-13 studies of nitrate fluxes in barley roots. 1. Compartmental analysis from measurements of 13N efflux. J. Exp. Bot. 37, 1753-1767 (1986).
- Coskun, D., Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Regulation and mechanism of potassium release from barley roots: an in planta 42K+ analysis. New Phytol. 188, 1028-1038 (2010).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J., Maathuis, F. .. J. .. M. .. ,. Fluxes measurements of cations using radioactive tracers. Plant Mineral Nutrients: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Volume 953, 161-170 (2013).
- Meeks, J. C., Knowles, R. ,., Blackburn, T. .. H. 13N techniques. Nitrogen isotope techniques. , 273-303 (1993).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Becker, A., Kronzucker, H. J. Rapid ammonia gas transport accounts for futile transmembrane cycling under NH3/NH4+ toxicity in plant roots. Plant Physiol. 163, 1859-1867 (2013).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Oh, S., Kronzucker, H. J. Capacity and plasticity of potassium channels and high-affinity transporters in roots of barley and Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).
- Johansson, I., et al. External K+ modulates the activity of the Arabidopsis potassium channel SKOR via an unusual mechanism. Plant J. 46, 269-281 (2006).
- Nocito, F. F., Sacchi, G. A., Cocucci, M. Membrane depolarization induces K+ efflux from subapical maize root segments. New Phytol. 154, 45-51 (2002).
- Wang, M. Y., Glass, A. D. M., Shaff, J. E., Kochian, L. V. Ammonium uptake by rice roots. 3. Electrophysiology. Plant Physiol. 104, 899-906 (1994).
- Walker, D. J., Leigh, R. A., Miller, A. J. Potassium homeostasis in vacuolate plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10510-10514 (1996).
- Holm, L. M., et al. NH3 and NH4+ permeability in aquaporin-expressing Xenopus oocytes. Pflugers Archiv. Eur. J. Physiol. 450, 415-428 (2005).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Trans-stimulation of 13NH4+ efflux provides evidence for the cytosolic origin of tracer in the compartmental analysis of barley roots. Funct. Plant Biol. 30, 1233-1238 (2003).
- Malagoli, P., Britto, D. T., Schulze, L. M., Kronzucker, H. J. Futile Na+ cycling at the root plasma membrane in rice (Oryza sativa L.): kinetics, energetics, and relationship to salinity tolerance. J. Exp. Bot. 59, 4109-4117 (2008).
- Kronzucker, H. J., Britto, D. T. Sodium transport in plants: a critical review. New Phytol. 189, 54-81 (2011).
