Rapid génotypage des animaux Suivi par Établir des cultures primaires de neurones du cerveau

Summary

Nous décrivons les procédures pour l'étiquetage et le génotypage des souris nouveau-nés et de générer des cultures de neurones primaires d'eux. Le génotypage est rapide, efficace et fiable, et permet pour l'extraction de l'acide nucléique automatisé. Ceci est particulièrement utile pour les souris néonatale létales et leurs cultures qui nécessitent l'achèvement préalable de génotypage.

Abstract

Analyse à haute résolution de la morphologie et la fonction des neurones de mammifères nécessite souvent le génotypage des animaux individuels, suivie par l'analyse des cultures primaires de neurones. Nous décrivons un ensemble de procédures pour: l'étiquetage souriceaux nouveau-nés pour être génotypés, le génotypage rapide, et l'établissement de cultures à faible densité de neurones du cerveau de ces souris. Souris individuels sont repérés par le tatouage, ce qui permet une identification à long terme durable à l'âge adulte. Génotypage par le protocole décrit est rapide et efficace, et permet l'extraction automatisée des acides nucléiques avec une bonne fiabilité. Ce est utile dans des circonstances où le temps suffisant pour le génotypage conventionnelle ne est pas disponible, par exemple, chez les souris qui souffrent de létalité néonatale. Cultures de neurones primaires sont générés à faible densité, qui permet des expériences d'imagerie à haute résolution spatiale. Cette méthode de culture nécessite la préparation de couches nourricières gliales avant le placage neuronale. Le pPROTOCOLE est appliquée dans sa totalité à un modèle de souris de la dystonie trouble du mouvement DYT1 (souris knock-in-torsinA AE), et les cultures neuronales sont préparées à partir de l'hippocampe, le cortex cérébral et le striatum de ces souris. Ce protocole peut être appliqué à des souris avec d'autres mutations génétiques, ainsi que pour d'autres espèces d'animaux. En outre, les composants individuels du protocole peut être utilisé pour les sous-projets isolés. Ainsi ce protocole aura de larges applications, non seulement en neurosciences, mais aussi dans d'autres domaines des sciences biologiques et médicales.

Introduction

des modèles de rongeurs de maladies génétiques se sont révélés utiles dans l'établissement des fonctions physiologiques normales de protéines et d'acides nucléiques, ainsi que les conséquences pathophysiologiques de défauts de ceux-ci. Des exemples comprennent les souris déficientes pour des protéines impliquées dans des fonctions cellulaires clés, ainsi que des modèles murins de maladies telles que la maladie d'Alzheimer. Cependant, certaines manipulations génétiques peuvent conduire à létalité néonatale peu ou quelques jours après la naissance. Dans ces cas, des cultures de cellules primaires sont un outil important parce que les cellules vivantes peuvent être obtenus auprès des chiots embryonnaires ou néonatales avant la mort, ils peuvent être conservés pendant au moins quelques semaines in vitro, et pendant ce temps le développement neuronal début peuvent être suivies par expériences biochimiques, morphologiques et fonctionnelles. Pour les cultures primaires, il peut être bénéfique à l'assiette les neurones à faible densité; ce qui permet de visualiser le soma individuel, dendrites, arbres axonales et le nerf termisignaux à haute résolution spatiale. Toutefois, la survie et la différenciation des neurones à faible densité nécessite généralement qu'ils sont étalées sur une couche nourricière gliale, co-cultivées avec des cellules gliales en l'absence de contact physique avec eux, ou cultivées dans du milieu conditionné par des cellules gliales ^1.

L'établissement de faible densité des cultures de neurones sur des couches nourricières gliales peut dépendre rapide et fiable génotypage préalable – dans un peu d'heures à la différence de quelques jours. La vitesse est particulièrement importante lorsque le génotype neuronal doit être adaptée à celle d'une couche d'alimentation gliale préparé à l'avance. A titre d'exemple plus pratique, il peut être nécessaire de décider lequel des chiots qui génotype à utiliser dans des cultures de production, afin d'optimiser l'efficacité d'une expérience.

Ici, nous démontrons le protocole de travail qui a été utilisé pour le génotypage de la souris rapide, simplifiée et fiable dans les publications précédentes ^2-6. Queues de souris etun kit disponible dans le commerce sont utilisés. Ce protocole comprend une seule étape d'extraction d'acides nucléiques à partir du tissu, et ne nécessite ni une étape de purification des acides nucléiques, ni l'utilisation d'un tampon de terminaison («stop solution"). La fiabilité de cette méthode de génotypage est illustré en présentant les résultats d'une série d'essais lorsque des différences sont introduites par rapport à la quantité de départ des échantillons, l'âge de l'animal et la longueur des amplicons PCR. Ce kit offre les avantages de l'extraction et la fiabilité automatisé.

Par souci d'être complet, l'utilisation du tatouage d'identification à long terme des souris génotypés est également démontrée. Le tatouage est réalisé par application d'une encre de tatouage dans le derme de la peau (sous l'épiderme) ^7. Un procédé est décrit pour le tatouage les coussinets des pattes de souris nouveau-nés ou de vieux un jour, bien que les tatouages ​​peuvent être appliqués à d'autres parties du corps, telles que les queues et les orteils, et animals de tous âges. En outre, les procédures seront montrées pour le placage et la culture de neurones de souris à une faible densité, sur la base de la préparation optimisée des différents types de couches nourricières gliales ^2,8.

On utilise un modèle de souris génétique du trouble neurologique héréditaire DYT1 dystonie – un trouble du mouvement autosomique dominante causée par une mutation dans le gène de TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) ^9. La protéine codée, torsinA, fait partie des "ATPases associées à diverses activités cellulaires" (AAA +) de la famille des protéines, dont les membres accomplissent généralement des fonctions de chaperon, en aidant à: dépliement des protéines, la protéine complexe de démontage, le trafic membranaire, et la fusion des vésicules ^10-13. Les résultats de mutation dans une délétion en cadre d'un codon pour l'acide glutamique, et peuvent conduire à la manifestation de «l'apparition précoce de la dystonie généralisée isolé» ^14,15. Cependant, la voieophysiological mécanismes responsables de cette maladie sont encore mal compris. Dans un modèle de souris knock-in, l'allèle mutant est Tor1a ^tm2Wtd, mentionné ci-après comme Tor1a ^AE. Hétérozygote AE-torsinA souris knock-in sont des patients humains viables et génétiquement imitent avec DYT1 dystonie, alors homozygote souris knock-in meurent après la naissance ^16,17, avec la latence à mort postnatale touchés par bagage génétique ^18. La mort précoce de souris knock-in homozygote nécessite que tant l'analyse génotypique des animaux et l'établissement de cultures de neurones sont achevées rapidement. Comme autre exemple de génotypage, TFAP2A (facteur de transcription AP-2α, la protéine de liaison d'activation activateur 2α) sera utilisée. La protéine codée par ce gène est important dans la régulation de nombreux processus cellulaires tels que la prolifération, la différenciation, la survie et l'apoptose ^19.

Protocol

NOTE: Toutes les procédures animales effectuées dans cette étude ont été approuvées par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université de l'Iowa. 1. identification à long terme des souris en utilisant tatouage les coussinets Immobiliser une patte avec le coussinet (surface plantaire) face à l'expérimentateur. Maintenez la patte avec le pouce et l'index. Veillez à ne pas pincer la patte. NOTE: Stable immobilisa…

Representative Results

Comme exemple de l'application de ce protocole, des résultats représentatifs sont présentés pour l'étiquetage des souris par le tatouage, le génotypage fiable dans diverses conditions expérimentales, et l'établissement de cultures de neurones primaires sur des couches nourricières gliales. Tatouage Les nouveau-nés ont été marqués sur les coussinets en utilisant un système de tatouage ('nouveau-né' de la …

Discussion

Le protocole présenté ici inclut des procédures pour le tatouage d'étiqueter / identifier les souris, pour le génotypage des souris de conseils de la queue, et pour la culture de neurones du cerveau de la souris à faible densité. Dans une série d'expériences utilisant 6-8 chiots, ces procédures exigent généralement ~ 0,5 h, ~ 4 h et ~ 2 heures, respectivement, à un total de 6-7 heures. Cela rend pratique pour une seule expérimentateur pour terminer toutes les procédures nécessaires à partir du m…

Materials

REAGENTS – tattooing
Machine Cleanser	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NMCR3	This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NDAR4	This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NBP01
Skin Prep Applicator	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NSPA1	Q-tip.
Skin Prep solution	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NSP01	This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS – genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)	EZ BioResearch LLC	G2001-100
2X PCR Ready Mix II	EZ BioResearch LLC	G2001-100	A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A	EZ BioResearch LLC	G2001-100	Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B	EZ BioResearch LLC	G2001-100	Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial	VWR	BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade	rpi	A20090-500	We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)	Fisher	BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl	Dot Scientific Inc	UG104-96RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl	Dot Scientific Inc	UG2020-RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl	Dot Scientific Inc	UG2812-RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp	EZ BioResearch LLC	L1001	We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp	EZ BioResearch LLC	L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder	GIBCO-Invitrogen	10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml	USA Scientific	1402-2900	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual	rpi	145660	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural	USA Scientific	1605-0000	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO	GIBCO-Invitrogen	S33102
Tris base	rpi	T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice			5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice			5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS – cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503-100MG	See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement	GIBCO-Invitrogen	17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated	BD falcon	353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml	BD falcon	353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml	BD falcon	353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml	BD falcon	352095
Countess (cell number counter) chamber slides	GIBCO-Invitrogen	C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)	Sigma-Aldrich	C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm	Pyrex	3160-101
Distilled water	GIBCO-Invitrogen	15230-147
DNase Type II	Sigma-Aldrich	D4527-200KU	Stock solution is prepared at 1500 units/20 μl = 75000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate	GIBCO-Invitrogen	10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size	Nalgene	568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size	Nalgene	569-0020
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO-Invitrogen	26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0	Carolina	633017
GlutaMAX-I	GIBCO-Invitrogen	35050-061
Hanks' Balanced Salts	Sigma-Aldrich	H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration)	Sigma-Aldrich	H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent	Sigma-Aldrich	258148-100 ML
Insulin	Sigma-Aldrich	I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka)	Sigma-Aldrich	63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free	BD Biosciences	356237	This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20°C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4°C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM)	GIBCO-Invitrogen	51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml	BD Biosciences	355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate	BD falcon	353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate	BD falcon	353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid	GIBCO-Invitrogen	10888-022
Nitric Acid	VWR	bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21	prepared in the lab		Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”	Fisher	13-678-6A	Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”	Fisher	13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0%	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Serological pipet, 2 ml	BD falcon	357507
Serological pipet, 5 ml	BD falcon	357543
Serological pipet, 10 ml	BD falcon	357551
Serological pipet, 25 ml	BD falcon	357525
Serological pipet, 50 ml	BD falcon	357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis	Sigma-Aldrich	480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich	Sigma-Aldrich	431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm	Corning	431219
Syringe, 3 ml	BD falcon	309585
Transferrin, Holo, bovine plasma	Calbiochem	616420
Trypan Blue stain, 0.4%	GIBCO-Invitrogen	T10282	This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI	Sigma-Aldrich	T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%	GIBCO-Invitrogen	25200-056
Uridine	Sigma-Aldrich	U3003-5G	Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125-mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS – immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2	Merck Millipore	AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail	Merck Millipore	NE1015