हम लेबलिंग के लिए और नवजात चूहों जीनोटाइपिंग और उन लोगों से प्राथमिक neuronal संस्कृतियों पैदा करने की प्रक्रियाओं का वर्णन है। जीनोटाइपिंग, तेजी से कुशल और विश्वसनीय है, और स्वचालित न्यूक्लिक एसिड निकासी के लिए अनुमति देता है। इस neonatally घातक चूहों और जीनोटाइपिंग की पूर्व पूरा होने की आवश्यकता है कि उनकी संस्कृतियों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है।
स्तनधारी न्यूरॉन्स की आकृति विज्ञान और समारोह के उच्च संकल्प विश्लेषण अक्सर न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृतियों के विश्लेषण के बाद अलग-अलग जानवरों के जीनोटाइपिंग की आवश्यकता है। Genotyped जा करने के लिए नवजात चूहों, तेजी से जीनोटाइपिंग लेबलिंग, और इन चूहों से मस्तिष्क न्यूरॉन्स के कम घनत्व संस्कृतियों की स्थापना: हम के लिए प्रक्रियाओं का एक सेट का वर्णन है। व्यक्तिगत चूहों वयस्कता में स्थायी लंबी अवधि की पहचान के लिए अनुमति देता है जो गोदना, द्वारा चिह्नित कर रहे हैं। वर्णित प्रोटोकॉल द्वारा जीनोटाइपिंग तेज और कुशल है, और अच्छा विश्वसनीयता के साथ न्यूक्लिक एसिड की स्वचालित निकासी के लिए अनुमति देता है। इस नवजात मारक से ग्रस्त हैं कि चूहों में, जैसे पारंपरिक जीनोटाइपिंग के लिए पर्याप्त समय उपलब्ध नहीं है जहां परिस्थितियों के तहत उपयोगी है। प्राथमिक neuronal संस्कृतियों उच्च स्थानिक संकल्प पर इमेजिंग प्रयोगों में सक्षम बनाता है जो कम घनत्व, कम से उत्पन्न कर रहे हैं। इस संस्कृति विधि से पहले न्यूरोनल चढ़ाना के लिए glial फीडर परतों की तैयारी की आवश्यकता है। पीrotocol आंदोलन विकार DYT1 दुस्तानता (ΔE-torsinA तोड़े में चूहों) के एक माउस मॉडल के लिए अपनी संपूर्णता में लागू किया जाता है, और neuronal संस्कृतियों इन चूहों के हिप्पोकैम्पस, सेरेब्रल कॉर्टेक्स और स्ट्रिएटम से तैयार कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल अन्य प्रजातियों के जानवरों के लिए, साथ ही अन्य आनुवंशिक परिवर्तन के साथ चूहों के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल की व्यक्तिगत घटकों को अलग-थलग उप-परियोजनाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रकार इस प्रोटोकॉल तंत्रिका विज्ञान में बल्कि जैविक और चिकित्सा विज्ञान के अन्य क्षेत्रों में न केवल व्यापक अनुप्रयोगों, होगा।
आनुवंशिक रोगों के कृंतक मॉडल सामान्य प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड होता है, साथ ही इन में दोष का pathophysiological परिणामों की शारीरिक कार्यों स्थापित करने में उपयोगी साबित किया है। उदाहरण कुंजी सेलुलर कार्यों में शामिल प्रोटीन के लिए चूहों की कमी है, साथ ही इस तरह के अल्जाइमर रोग के रूप में विकारों के माउस मॉडल शामिल हैं। हालांकि, कुछ आनुवंशिक जोड़तोड़ शीघ्र ही नवजात मारक या जन्म के बाद कुछ दिनों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। इन मामलों में, प्राथमिक सेल संस्कृतियों जीवित कोशिकाओं मौत से पहले भ्रूण या नवजात पिल्ले से प्राप्त किया जा सकता है, क्योंकि एक महत्वपूर्ण उपकरण है, वे इन विट्रो में कम से कम एक कुछ हफ्तों के लिए बनाए रखा जा सकता है, और इस समय के दौरान जल्दी neuronal विकास के द्वारा पीछा किया जा सकता है जैव रासायनिक कार्यात्मक और रूपात्मक प्रयोगों। प्राथमिक संस्कृतियों के लिए, यह कम घनत्व में न्यूरॉन्स थाली करने के लिए फायदेमंद हो सकता है; इस व्यक्ति somata, डेन्ड्राइट, axonal शाफ्ट और तंत्रिका termi कल्पना करने के लिए यह संभव बनाता हैउच्च स्थानिक संकल्प पर nals। हालांकि, कम घनत्व में न्यूरॉन्स के अस्तित्व और भेदभाव आम तौर पर वे एक glial फीडर परत पर चढ़ाया जाता है कि आवश्यकता है, सह सुसंस्कृत glia एक से वातानुकूलित शारीरिक उन लोगों के साथ संपर्क, या माध्यम सुसंस्कृत के अभाव में glial कोशिकाओं के साथ।
glial फीडर परतों पर कम घनत्व neuronal संस्कृतियों की स्थापना के पहले से तेज और विश्वसनीय जीनोटाइपिंग पर निर्भर हो सकता है – कुछ दिनों के लिए इसके विपरीत में कुछ घंटे के भीतर। न्यूरोनल जीनोटाइप पहले से तैयार एक glial फीडर परत की है कि करने के लिए मिलान करने की आवश्यकता है जब स्पीड विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। एक और अधिक व्यावहारिक उदाहरण के रूप में, यह जो जीनोटाइप के पिल्ले एक प्रयोग की दक्षता का अनुकूलन करने के लिए, पैदा करने संस्कृतियों में उपयोग करने के लिए जो तय करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
यहाँ हम पिछले प्रकाशनों 2-6 में, तेजी से सरल और विश्वसनीय माउस जीनोटाइपिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है कि काम कर रहे प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है। माउस पूंछ औरएक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का इस्तेमाल किया जाता है। इस प्रोटोकॉल के ऊतकों से न्यूक्लिक एसिड के एकल चरण निकासी भी शामिल है, और ('समाधान रोक') एक न्यूक्लिक एसिड शुद्धि कदम है और न ही एक समाप्ति बफर का उपयोग न होने की आवश्यकता है। इस जीनोटाइपिंग विधि की विश्वसनीयता मतभेद नमूनों के शुरू राशि, जानवरों की उम्र और पीसीआर amplicons की लंबाई के लिए सम्मान के साथ पेश कर रहे हैं जब परीक्षणों की एक श्रृंखला के परिणाम पेश करने से यह साफ है। इस किट स्वचालित निकासी और विश्वसनीयता का लाभ प्रदान करता है।
व्यापक किया जा रहा है की खातिर, genotyped चूहों की लंबी अवधि की पहचान के लिए गोदने का उपयोग भी प्रदर्शन किया है। गोदना (एपिडर्मिस) के तहत त्वचा की dermis के लिए गोदना स्याही लगाने से हासिल की है 7। एक प्रक्रिया टैटू ऐसे पूंछ और पैर की उंगलियों के रूप में शरीर के अन्य भागों के लिए लागू किया जा सकता है, हालांकि नवजात शिशु या एक दिन पुराने चूहों का पंजा पैड गोदने के लिए वर्णन किया गया है, और anim के लिएसभी उम्र के ए एल एस। इसके अलावा, प्रक्रियाओं glial फीडर परतों 2,8 के विभिन्न प्रकार के अनुकूलित तैयारी पर आधारित है, एक कम घनत्व पर माउस न्यूरॉन्स चढ़ाना और संवर्धन के लिए प्रदर्शन किया जाएगा।
(; P.Glu302del / p.Glu303del c.904_906delGAG / c.907_909delGAG) 9 जीन TOR1A में उत्परिवर्तन के कारण एक autosomal प्रमुख आंदोलन विकार – हम विरासत में मिला मस्तिष्क संबंधी विकार DYT1 दुस्तानता की एक आनुवंशिक माउस मॉडल का उपयोग करें। प्रोटीन खुलासा, प्रोटीन जटिल disassembly, झिल्ली तस्करी, और पुटिका संलयन: इनकोडिंग प्रोटीन, torsinA, जिसके सदस्य आम तौर पर, निगरानी की तरह कार्य करते हैं में सहायता (एएए +) प्रोटीन का परिवार, "विविध सेलुलर गतिविधियों से जुड़े ATPases" के अंतर्गत आता है 10-13। उत्परिवर्तन glutamic एसिड के लिए एक कोडोन का एक में फ्रेम विलोपन में परिणाम है, और 'पहले ही शुरू होने सामान्यीकृत पृथक दुस्तानता' 14,15 की अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। हालांकि, पथइस अव्यवस्था के लिए जिम्मेदार ophysiological तंत्र खराब समझ रहते हैं। एक दस्तक में माउस मॉडल में, उत्परिवर्ती एलील Tor1a ΔE के रूप में इसके बाद उल्लेख Tor1a tm2Wtd है। विषमयुग्मजी ΔE-torsinA तोड़े में चूहों DYT1 दुस्तानता साथ व्यवहार्य और आनुवंशिक रूप से नकल मानव रोगियों कर रहे हैं, जबकि समयुग्मक तोड़े में चूहों आनुवंशिक पृष्ठभूमि 18 से प्रभावित प्रसव के बाद मौत के लिए विलंबता के साथ, जन्म 16,17 के बाद मर जाते हैं। समयुग्मक तोड़े में चूहों की जल्दी मौत जानवरों की जीनोटाइपिंग और neuronal संस्कृतियों की स्थापना दोनों तेजी से पूरा कर रहे हैं कि जरूरी। जीनोटाइपिंग का एक और उदाहरण के रूप में, Tfap2a (प्रतिलेखन कारक एपी-2α, बढ़ाने प्रोटीन 2α बाध्यकारी को सक्रिय करने) का उपयोग किया जाएगा। इस जीन द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन ऐसे प्रसार, भेदभाव, अस्तित्व और apoptosis 19 के रूप में कई सेलुलर प्रक्रियाओं, विनियमित करने में महत्वपूर्ण है।
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल पूंछ सुझावों से चूहों जीनोटाइपिंग के लिए, / लेबल चूहों की पहचान करने के गोदने के लिए प्रक्रियाओं में शामिल हैं, और कम घनत्व पर संवर्धन माउस मस्तिष्क न्यूरॉन्स के लिए। 6-8 पिल्ले क…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank researchers at the University of Iowa, Drs. Luis Tecedor, Ines Martins and Beverly Davidson for instructions and helpful comments regarding striatal cultures, and Drs. Kara Gordon, Nicole Bode and Pedro Gonzalez-Alegre for genotyping assistance and discussions. We also thank Dr. Eric Weyand (Animal Identification and Marking Systems) for helpful comments regarding tattooing, and Dr. Shutaro Katsurabayashi (Fukuoka University) for helpful comments regarding the mouse culture. This work was supported by grants from the American Heart Association, the Department of Defense (Peer Reviewed Medical Research Program award W81XWH-14-1-0301), the Dystonia Medical Research Foundation, the Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, the National Science Foundation, and the Whitehall Foundation (N.C.H.).
REAGENTS – tattooing | |||
Machine Cleanser | Animal Identification and Marking Systems, Inc. | NMCR3 | This is used to clean the needles and the holder after tattooing. |
Machine Drying Agent | Animal Identification and Marking Systems, Inc. | NDAR4 | This is used to dry the needles and holder after cleaning. |
Neonate Tattoo Black Pigment | Animal Identification and Marking Systems, Inc. | NBP01 | |
Skin Prep Applicator | Animal Identification and Marking Systems, Inc. | NSPA1 | Q-tip. |
Skin Prep solution | Animal Identification and Marking Systems, Inc. | NSP01 | This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated. |
REAGENTS – genotyping | |||
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format) | EZ BioResearch LLC | G2001-100 | |
2X PCR Ready Mix II | EZ BioResearch LLC | G2001-100 | A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution. |
Tissue Lysis Solution A | EZ BioResearch LLC | G2001-100 | Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen. |
Tissue Lysis Solution B | EZ BioResearch LLC | G2001-100 | Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen. |
Acetic acid, glacial | VWR | BDH 3092 | |
Agarose optimized grade, molecular biology grade | rpi | A20090-500 | We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume). |
Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA) | Fisher | BP120-500 | |
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl | Dot Scientific Inc | UG104-96RS | Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination. |
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl | Dot Scientific Inc | UG2020-RS | Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination. |
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl | Dot Scientific Inc | UG2812-RS | Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination. |
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp | EZ BioResearch LLC | L1001 | We use either of these three molecular weight markers. |
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp | EZ BioResearch LLC | L1010 | |
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder | GIBCO-Invitrogen | 10488-058 | |
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml | USA Scientific | 1402-2900 | Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes. |
PCR tubes, Ultraflux Individual | rpi | 145660 | Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. |
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural | USA Scientific | 1605-0000 | Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. |
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO | GIBCO-Invitrogen | S33102 | |
Tris base | rpi | T60040-1000 | |
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice | 5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2). | ||
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice | 5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM. | ||
REAGENTS – cell culture | |||
5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100MG | See comments section of uridine for more information. |
B-27 supplement | GIBCO-Invitrogen | 17504-044 | |
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated | BD falcon | 353001 | |
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml | BD falcon | 353082 | |
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml | BD falcon | 353136 | |
Conical Tube, polypropylene, 15 ml | BD falcon | 352095 | |
Countess (cell number counter) chamber slides | GIBCO-Invitrogen | C10312 | |
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C6645-100mg | |
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | G7528-250G | |
Dish, Petri glass 100 x 15 mm | Pyrex | 3160-101 | |
Distilled water | GIBCO-Invitrogen | 15230-147 | |
DNase Type II | Sigma-Aldrich | D4527-200KU | Stock solution is prepared at 1500 units/20 μl = 75000 units/ml in distilled water. |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate | GIBCO-Invitrogen | 10569-010, 500 ml | |
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size | Nalgene | 568-0020 | |
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size | Nalgene | 569-0020 | |
Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO-Invitrogen | 26140-079 | |
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0 | Carolina | 633017 | |
GlutaMAX-I | GIBCO-Invitrogen | 35050-061 | |
Hanks' Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387-10X | |
HEPES, ≥99.5% (titration) | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent | Sigma-Aldrich | 258148-100 ML | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I5500-250 mg | |
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka) | Sigma-Aldrich | 63138-250G | |
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free | BD Biosciences | 356237 | This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20°C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4°C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying. |
Minimum Essential Medium (MEM) | GIBCO-Invitrogen | 51200-038 | |
MITO+ Serum Extender, 5 ml | BD Biosciences | 355006 | |
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate | BD falcon | 353047 | |
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate | BD falcon | 353046 | |
Neurobasal-A Medium (1X), liquid | GIBCO-Invitrogen | 10888-022 | |
Nitric Acid | VWR | bdh 3044 | |
NS (Neuronal Supplement) 21 | prepared in the lab | Source: reference 69 | |
Pasteur pipets, 5 ¾” | Fisher | 13-678-6A | Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration. |
Pasteur pipets, 9” | Fisher | 13-678-6B | |
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
Serological pipet, 2 ml | BD falcon | 357507 | |
Serological pipet, 5 ml | BD falcon | 357543 | |
Serological pipet, 10 ml | BD falcon | 357551 | |
Serological pipet, 25 ml | BD falcon | 357525 | |
Serological pipet, 50 ml | BD falcon | 357550 | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis | Sigma-Aldrich | 480878-250G | |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich | Sigma-Aldrich | 431478-250G | |
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S7903-250G | |
Syringe filter, sterile, 0.2 µm | Corning | 431219 | |
Syringe, 3 ml | BD falcon | 309585 | |
Transferrin, Holo, bovine plasma | Calbiochem | 616420 | |
Trypan Blue stain, 0.4% | GIBCO-Invitrogen | T10282 | This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density. |
Trypsin, type XI | Sigma-Aldrich | T1005-5G | |
Trypsin-EDTA solution, 0.25% | GIBCO-Invitrogen | 25200-056 | |
Uridine | Sigma-Aldrich | U3003-5G | Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125-mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively). |
REAGENTS – immunocytochemistry | |||
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2 | Merck Millipore | AB5622 | |
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail | Merck Millipore | NE1015 |