동물의 신속한 유전자형은 뇌 신경 세포의 차 문화 구축에 이어

Summary

우리는 라벨 및 신생아 쥐의 유전형과 그들로부터 차의 연결을 문화를 생성하는 절차에 대해 설명합니다. 유전자형은 신속하고 효율적이며 신뢰성 및 자동 핵산 추출 할 수 있습니다. 이 neonatally 치명적인 마우스와 유전자형의 이전 완료를 필요로 그들의 문화에 특히 유용합니다.

Abstract

포유류 신경 세포의 형태와 기능의 고해상도 분석은 종종 뉴런의 일차 배양 분석 하였다 개별 동물의 유전자형을 필요로한다. 유전자형되는 신생아 마우스, 빠른 유전자형 레이블, 이러한 마우스의 뇌 신경 세포의 저밀도 문화를 확립 : 우리는 절차의 집합을 설명합니다. 개별 마우스는 성인이 지속되는 장기 식별 할 수 있습니다 문신에 의해 표시되어 있습니다. 설명 프로토콜에 의한 유전자형 빠르고 효율적이며, 좋은 안정성과 핵산 자동 추출 할 수 있습니다. 이 신생아 치사 고통 생쥐에서, 예를 들어 기존의 유전자형 충분한 시간을 사용할 수없는 상황에서 유용합니다. 기본의 연결을 문화가 높은 공간 해상도 이미징 실험을 가능하게 낮은 밀도에서 생성됩니다. 이 배양법 종래 신경 교세포 도금 세포층의 제조를 필요로한다. Protocol은 운동 장애 DYT1 된 근긴장 (ΔE-torsinA 녹아웃 생쥐)의 마우스 모델에 전체적으로 도포하고, 신경 세포 배양은 이들 마우스의 해마, 대뇌 피질 및 선조체로부터 제조된다. 이 프로토콜은 다른 종의 동물뿐만 아니라, 다른 유전 적 돌연변이 마우스에 적용 할 수있다. 또한, 프로토콜의 개별 구성 요소는 격리 된 서브 프로젝트를 위해 사용될 수있다. 따라서이 프로토콜은 신경 과학뿐만 아니라 생물학 및 의료 과학의 다른 분야에서뿐만 아니라 다양한 응용 프로그램을해야합니다.

Introduction

유전병의 설치류 모델은 정상 단백질과 핵산뿐만 아니라, 이들의 결함의 병태 생리 학적 결과의 생리 기능을 확립하는데 유용 입증되었다. 예로는 주요 세포 기능에 관여하는 단백질 결핍 마우스뿐만 아니라 알츠하이머 질환과 같은 질환의 마우스 모델을 포함한다. 그러나, 특정 유전자 조작 곧 신생아 치사 또는 출생 후 몇 일이 발생할 수 있습니다. 이 경우, 일차 세포 배양 생균 사망 전 배아 또는 신생아 새끼로부터 획득 될 수 있기 때문에 중요한 도구들은 시험 관내에서의 적어도 몇 주 동안 유지 될 수 있으며,이 시간 동안 초기 신경 발달은 다음 수 생화학 적 기능과 형태 학적 실험. 차 배양 들어, 저밀도 뉴런 판형 것이 유익 할 수있다; 이것은 개별 세포체, 수상 돌기 축삭 통로 및 신경 TERMI을 시각화하는 것을 가능하게높은 공간 해상도 NALS. 그러나, 낮은 밀도에서 뉴런의 생존과 분화는 일반적으로 그들이 신경교 영양 세포층에 플레이 팅되는 것을 필요로 공 배양 ^한 신경교 의해 컨디셔닝 물리적 그들과 접촉, 또는 배지에서의 부재와 신경 교세포.

아교 세포층에 저밀도의 연결을 문화의 설립은 사전에 신속하고 신뢰할 수 유전자형에 종속 될 수 있습니다 – 몇 일에 대비 몇 시간 내에. 신경 유전자형 미리 준비된 신경교 세​​포층의 것과 일치해야 할 때 속도는 특히 중요하다. 더 구체적인 예로서, 그 유전자형이 새끼 실험의 효율을 최적화하기 위해, 생성 배양에 사용할 것인지를 결정하는 것이 필요할 수있다.

여기에서 우리는 이전의 출판물 ^2-6, 빠르고 간단하고 신뢰할 수있는 마우스 유전자형에 사용 된 작업 프로토콜을 보여줍니다. 마우스 꼬리와시중에서 판매하는 키트가 사용된다. 이 프로토콜은 조직으로부터의 단일 핵산 추출 단계를 포함하고, ( '정지 용액'), 핵산 정제 공정이나 종단 버퍼의 이용도를 필요로한다. 유전자형이 방법의 신뢰성은 차이 시험편의 개시 량, 동물의 연령 및 PCR 증폭 산물의 길이에 대하여 소개하는 경우 일련의 테스트의 결과를 제시하여 설명한다. 이 키트는 자동 추출 및 신뢰성의 이점을 제공한다.

포괄적 인 위해, 유전자형 생쥐의 장기 식별 문신의 용도도 설명된다. 문신 (표피 하) 피부의 진피 문신 잉크를 적용함으로써 달성된다 ^7. 절차가 이러한 꼬리 문신 발가락 등 신체의 다른 부분에 적용 할 수 있지만, 신생아 또는 1 일된 쥐의 발바닥 문신에 기술되고,하기 ANIM모든 연령의 루게릭 병. 또한 절차는 신경교 세포층 ^2,8의 다른 유형의 최적화에 기초하여 제조, 저농도 마우스 뉴런 도금 및 배양 입증 될 것이다.

(; p.Glu302del / p.Glu303del c.904_906delGAG / c.907_909delGAG) ⁹ 유전자 TOR1A의 돌연변이에 의해 발생하는 상 염색체 지배적 인 운동 장애 – 우리는 상속 된 신경 학적 장애 DYT1의 근육 긴장의 유전 마우스 모델을 사용하고 있습니다. 단백질 전개, 단백질 복잡한 분해, 막 인신 매매 및 소포 융합 : 인코딩 된 단백질, torsinA는, 누구의 회원 일반적으로, 보호자와 같은 기능을 수행에서 지원 (단 +) 단백질의 가족, "다양한 세포 활동과 연관 -ATPase를"에 속하는 ^10-13. 돌연변이 글루탐산에 대한 코돈의에서 프레임 삭제하고 따라서 '조기 발병 일반화 고립 된 근육 긴장 ^{이상'14, 15의} 발현으로 이어질 수 있습니다. 그러나, 경로이 질환에 대한 책임 ophysiological 메커니즘을 제대로 이해 남아있다. 녹아웃 마우스 모델에서, 돌연변이 대립 유전자 Tor1a ^ΔE로 이하 언급 Tor1a ^{tm2Wtd이다.} 이형 ΔE-torsinA 녹아웃 생쥐 DYT1의 근육 긴장 이상으로 실행 가능하고 유 전적으로 모방 인간의 환자이며, 반면에 동형 접합 노크에 쥐가 유전 적 배경 ^(18)에 의해 영향을받는 출생 후 사망에 대기 시간, 출생 ^{16, 17} 후 죽는다. 동형 접합 노크에서 마우스의 조기 사망은 동물의 유전자형과의 연결을 문화의 설립이 모두 빠르게 완료되었는지 필요로한다. 유전자형의 다른 예로서, Tfap2a (전사 인자는 AP-2α, 인핸서 2α 단백질 결합을 활성화하는) 사용될 것이다. 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 증식, 분화, 생존 및 사멸 ⁽¹⁹⁾ 같은 다수의 세포 과정을 조절하는 것이 중요하다.

Protocol

참고 : 본 연구에서 수행되는 모든 동물 절차는 아이오와 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 발 패드를 문신 사용하여 마우스 1. 장기 식별 실험에 직면 발 패드 (발바닥 표면)과 발을 고정. 엄지 손가락과 집게 손가락으로 발바닥을 잡아. 발을 끼지 않도록주의하십시오. 주 : 안정 고정화 문신 안료 발 패드의 진피 내로 배치되도록하?…

Representative Results

이 프로토콜의 적용 예를 들어, 대표적인 결과는 다양한 실험 조건 하에서 문신, 신뢰할 수있는 유전자형으로 마우스를 라벨 및 아교 피더 레이어에 기본의 연결을 문화를 확립 표시됩니다. 문신 신생아 새끼 (그림 1에서 '신생아') 문신 시스템을 사용하여 발바닥에 표시 하였다. 라벨 3 주에서 명확하게 볼 남아 ( '3 주?…

Discussion

The protocol presented here includes procedures for tattooing to label/identify mice, for genotyping mice from tail tips, and for culturing mouse brain neurons at low density. In one round of experiments using 6-8 pups, these procedures typically require ~0.5 hr, ~4 hr and ~2 hr, respectively, at a total of 6-7 hr. This makes it practical for a single experimenter to complete all the procedures necessary from the time of the pups' birth to the plating of neuronal cultures – in less than a single working day (wi…

Materials

REAGENTS – tattooing
Machine Cleanser	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NMCR3	This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NDAR4	This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NBP01
Skin Prep Applicator	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NSPA1	Q-tip.
Skin Prep solution	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NSP01	This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS – genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)	EZ BioResearch LLC	G2001-100
2X PCR Ready Mix II	EZ BioResearch LLC	G2001-100	A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A	EZ BioResearch LLC	G2001-100	Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B	EZ BioResearch LLC	G2001-100	Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial	VWR	BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade	rpi	A20090-500	We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)	Fisher	BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl	Dot Scientific Inc	UG104-96RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl	Dot Scientific Inc	UG2020-RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl	Dot Scientific Inc	UG2812-RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp	EZ BioResearch LLC	L1001	We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp	EZ BioResearch LLC	L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder	GIBCO-Invitrogen	10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml	USA Scientific	1402-2900	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual	rpi	145660	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural	USA Scientific	1605-0000	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO	GIBCO-Invitrogen	S33102
Tris base	rpi	T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice			5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice			5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS – cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503-100MG	See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement	GIBCO-Invitrogen	17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated	BD falcon	353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml	BD falcon	353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml	BD falcon	353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml	BD falcon	352095
Countess (cell number counter) chamber slides	GIBCO-Invitrogen	C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)	Sigma-Aldrich	C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm	Pyrex	3160-101
Distilled water	GIBCO-Invitrogen	15230-147
DNase Type II	Sigma-Aldrich	D4527-200KU	Stock solution is prepared at 1500 units/20 μl = 75000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate	GIBCO-Invitrogen	10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size	Nalgene	568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size	Nalgene	569-0020
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO-Invitrogen	26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0	Carolina	633017
GlutaMAX-I	GIBCO-Invitrogen	35050-061
Hanks' Balanced Salts	Sigma-Aldrich	H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration)	Sigma-Aldrich	H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent	Sigma-Aldrich	258148-100 ML
Insulin	Sigma-Aldrich	I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka)	Sigma-Aldrich	63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free	BD Biosciences	356237	This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20°C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4°C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM)	GIBCO-Invitrogen	51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml	BD Biosciences	355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate	BD falcon	353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate	BD falcon	353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid	GIBCO-Invitrogen	10888-022
Nitric Acid	VWR	bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21	prepared in the lab		Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”	Fisher	13-678-6A	Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”	Fisher	13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0%	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Serological pipet, 2 ml	BD falcon	357507
Serological pipet, 5 ml	BD falcon	357543
Serological pipet, 10 ml	BD falcon	357551
Serological pipet, 25 ml	BD falcon	357525
Serological pipet, 50 ml	BD falcon	357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis	Sigma-Aldrich	480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich	Sigma-Aldrich	431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm	Corning	431219
Syringe, 3 ml	BD falcon	309585
Transferrin, Holo, bovine plasma	Calbiochem	616420
Trypan Blue stain, 0.4%	GIBCO-Invitrogen	T10282	This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI	Sigma-Aldrich	T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%	GIBCO-Invitrogen	25200-056
Uridine	Sigma-Aldrich	U3003-5G	Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125-mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS – immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2	Merck Millipore	AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail	Merck Millipore	NE1015