Rápido Genotipado de animales seguidas del establecimiento de cultivos primarios de neuronas cerebrales

Summary

Se describe procedimientos para el etiquetado y la genotipificación ratones recién nacidos y la generación de cultivos primarios de neuronas de ellos. La genotipificación es rápida, eficiente y fiable, y permite la extracción automatizada de ácido nucleico. Esto es especialmente útil para los ratones neonatally letales y sus culturas que requieren previa cumplimentación del genotipado.

Abstract

Análisis de alta resolución de la morfología y función de las neuronas de mamíferos a menudo requiere la determinación del genotipo de los animales individuales, seguido por el análisis de cultivos primarios de neuronas. Se describe un conjunto de procedimientos para: etiquetado de los ratones recién nacidos que se genotipo, genotipificación rápida, y el establecimiento de cultivos de baja densidad de las neuronas del cerebro de estos ratones. Ratones individuales están etiquetados por los tatuajes, que permite la identificación a largo plazo que dura hasta la edad adulta. Genotipado por el protocolo descrito es rápido y eficiente, y permite la extracción automatizada de ácido nucleico con una buena fiabilidad. Esto es útil en circunstancias donde el tiempo suficiente para el genotipado convencional no está disponible, por ejemplo, en los ratones que sufren de letalidad neonatal. Cultivos primarios de neuronas se generan a baja densidad, que permite a los experimentos de imagen a alta resolución espacial. Este método de cultivo requiere la preparación de capas de alimentación gliales antes de chapado neuronal. El protocol se aplica en su totalidad a un modelo de ratón de la distonía trastorno del movimiento DYT1 (AE-torsinA ratones knock-in), y cultivos neuronales se prepara a partir del hipocampo, la corteza cerebral y el estriado de estos ratones. Este protocolo se puede aplicar a los ratones con otras mutaciones genéticas, así como a animales de otras especies. Además, los componentes individuales del protocolo se pueden utilizar para los sub-proyectos aislados. Por lo tanto este protocolo tendrá amplias aplicaciones, no sólo en la neurociencia, sino también en otros campos de las ciencias biológicas y médicas.

Introduction

Modelos de roedores de enfermedades genéticas han demostrado ser útiles en el establecimiento de las funciones fisiológicas de las proteínas normales y ácidos nucleicos, así como las consecuencias fisiopatológicas de defectos en estos. Los ejemplos incluyen ratones deficientes para proteínas implicadas en funciones celulares clave, así como modelos de ratón de trastornos tales como la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, ciertas manipulaciones genéticas pueden conducir a la letalidad neonatal poco o unos pocos días después del nacimiento. En estos casos, los cultivos celulares primarios son una herramienta importante porque las células vivas se pueden obtener de las crías de embriones o neonatales antes de la muerte, que pueden mantenerse durante al menos un par de semanas in vitro, y durante este tiempo el desarrollo neuronal temprana pueden ser seguidos por experimentos bioquímicos, morfológicos y funcionales. Para los cultivos primarios, puede ser beneficioso para la placa de las neuronas a baja densidad; esto hace que sea posible visualizar la somata individual, dendritas, árboles axonal y termi nervionales en alta resolución espacial. Sin embargo, la supervivencia y la diferenciación de las neuronas a baja densidad típicamente requiere que se colocan en una capa alimentadora glial, co-cultivadas con células gliales en la ausencia de contacto físico con ellos, o se cultivaron en medio acondicionado por células gliales ^1.

El establecimiento de cultivos neuronales de baja densidad en capas alimentadoras gliales puede depender de rápido y fiable de genotipado de antemano – dentro de unas pocas horas en contraste con unos pocos días. La velocidad es especialmente importante cuando el genotipo neuronal necesita ser adaptada a la de una capa alimentadora glial preparado de antemano. Como un ejemplo más práctico, puede ser necesario decidir que las crías de que el genotipo para usar en cultivos de generación, para optimizar la eficiencia de un experimento.

Aquí demostramos el protocolo de trabajo que se ha utilizado para una rápida y simplificada y fiable de genotipado de ratón en publicaciones anteriores ^2-6. Colas de ratón yse utilizó un kit disponible comercialmente. Este protocolo incluye la extracción de una sola etapa de los ácidos nucleicos a partir del tejido, y no requiere ni una etapa de purificación de ácido nucleico ni el uso de un tampón de terminación ("solución de parada '). La fiabilidad de este método de genotipificación se ilustra mediante la presentación de los resultados de una serie de pruebas cuando se introducen las diferencias con respecto a la cantidad de partida de los especímenes, la edad de los animales y la longitud de los amplicones de PCR. Este kit ofrece las ventajas de la extracción y la fiabilidad automatizado.

Por el bien de ser integral, también se demuestra el uso de los tatuajes para la identificación a largo plazo de los ratones con genotipo. El tatuaje se logra mediante la aplicación de la tinta de tatuaje en la dermis de la piel (debajo de la epidermis) ^7. Se describe un procedimiento para el tatuaje las almohadillas de las patas de ratones recién nacidos o 1 día de edad, aunque los tatuajes se pueden aplicar a otras partes del cuerpo, tales como colas y dedos de los pies, y para animals, de todas las edades. Además, los procedimientos se demostrarán para el recubrimiento y el cultivo de neuronas de ratón a una densidad baja, basado en la preparación optimizada de diferentes tipos de capas de alimentación gliales ^2,8.

Usamos un modelo genético de ratón de la enfermedad neurológica DYT1 distonía heredado – un trastorno de movimiento autosómica dominante causada por una mutación en el gen TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) ^9. La proteína codificada, torsinA, pertenece a los "ATPasas asociados a diversas actividades celulares" (AAA +) familia de proteínas, cuyos miembros en general, desempeñará las funciones de tipo chaperón, la asistencia en: proteína que se desarrollan, desmontaje-proteína compleja, el tráfico de membrana, y la fusión de vesículas ^10-13. La mutación en un marco de supresión de un codón para el ácido glutámico, y pueden llevar a la manifestación de "inicio temprano generalizado aislado distonía ^'14,15. Sin embargo, el caminomecanismos ophysiological responsables de este trastorno siguen siendo poco conocidos. En un modelo de ratón knock-in, el alelo mutante es TOR1A ^tm2Wtd, mencionado en lo sucesivo como TOR1A ^AE. Heterocigota? E-torsinA knock-en ratones son pacientes humanos viables genéticamente y mímicas con distonía DYT1, mientras homocigotos ronda en ratones mueren después del nacimiento ^16,17, con la latencia a la muerte postnatal afectados por los antecedentes genéticos ^18. La temprana muerte de homocigotos ratones knock-in requiere que tanto la determinación del genotipo de los animales y el establecimiento de cultivos neuronales se completan rápidamente. Como otro ejemplo de genotipado, TFAP2A (factor de transcripción AP-2α, la activación de la proteína de unión a 2α potenciador) se utilizará. La proteína codificada por este gen es importante en la regulación de múltiples procesos celulares, tales como la proliferación, la diferenciación, la supervivencia y apoptosis ^19.

Protocol

NOTA: Todos los animales procedimientos realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Iowa. Identificación 1. a largo plazo de ratones utilizando Tatuaje las almohadillas de las patas Inmovilizar una pata con la (superficie plantar) almohadilla plantar cara al experimentador. Sostenga la pata con el pulgar y el dedo índice. Tenga cuidado de no pellizcar la pata. NOTA: inmovilización estable es i…

Representative Results

Como ejemplo de la aplicación de este protocolo, los resultados representativos se muestran para el etiquetado de los ratones por los tatuajes, genotipificación fiable en diversas condiciones experimentales, y el establecimiento de cultivos primarios de neuronas en capas de alimentación gliales. El tatuaje Los cachorros recién nacidos fueron marcadas en las almohadillas de las patas utilizando un sistema de tatuajes ('recién nacido' …

Discussion

El protocolo que aquí se presenta incluye procedimientos para tatuar etiquetar / identificar los ratones, para el genotipado de los ratones de cola consejos, y para el cultivo de neuronas del cerebro del ratón en baja densidad. En una ronda de experimentos utilizando 6-8 crías, estos procedimientos requieren típicamente ~ 0,5 h, ~ 4 horas y ~ 2 h, respectivamente, en un total de 07.06 h. Esto hace que sea práctico para un solo experimentador para completar todos los trámites necesarios desde el momento del nacimie…

Materials

REAGENTS – tattooing
Machine Cleanser	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NMCR3	This is used to clean the needles and the holder after tattooing.
Machine Drying Agent	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NDAR4	This is used to dry the needles and holder after cleaning.
Neonate Tattoo Black Pigment	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NBP01
Skin Prep Applicator	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NSPA1	Q-tip.
Skin Prep solution	Animal Identification and Marking Systems, Inc.	NSP01	This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage – the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing – softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.
REAGENTS – genotyping
EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)	EZ BioResearch LLC	G2001-100
2X PCR Ready Mix II	EZ BioResearch LLC	G2001-100	A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.
Tissue Lysis Solution A	EZ BioResearch LLC	G2001-100	Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Tissue Lysis Solution B	EZ BioResearch LLC	G2001-100	Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 µl of Tissue Lysis Solution A and 180 µl of Tissue Lysis Solution B per specimen.
Acetic acid, glacial	VWR	BDH 3092
Agarose optimized grade, molecular biology grade	rpi	A20090-500	We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 µg/ml gel volume).
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E7637-1G
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)	Fisher	BP120-500
Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 µl	Dot Scientific Inc	UG104-96RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 µl	Dot Scientific Inc	UG2020-RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 µl	Dot Scientific Inc	UG2812-RS	Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp	EZ BioResearch LLC	L1001	We use either of these three molecular weight markers.
Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp	EZ BioResearch LLC	L1010
Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder	GIBCO-Invitrogen	10488-058
PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml	USA Scientific	1402-2900	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.
PCR tubes, Ultraflux Individual	rpi	145660	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural	USA Scientific	1605-0000	Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.
SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO	GIBCO-Invitrogen	S33102
Tris base	rpi	T60040-1000
Primers for amplifying Tor1a gene in ΔE-torsinA knock-in mice			5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (forward) and 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/µl (~0.16 µM) (reference 2).
Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice			5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (forward), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverse) for the 498-bp amplicon, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (forward), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 µM.
REAGENTS – cell culture
5-Fluoro-2′-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503-100MG	See comments section of uridine for more information.
B-27 supplement	GIBCO-Invitrogen	17504-044
Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated	BD falcon	353001
Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm2 Growth Area, 70 ml	BD falcon	353082
Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm2 Growth Area, 250 ml	BD falcon	353136
Conical Tube, polypropylene, 15 ml	BD falcon	352095
Countess (cell number counter) chamber slides	GIBCO-Invitrogen	C10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)	Sigma-Aldrich	C6645-100mg
D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	G7528-250G
Dish, Petri glass 100 x 15 mm	Pyrex	3160-101
Distilled water	GIBCO-Invitrogen	15230-147
DNase Type II	Sigma-Aldrich	D4527-200KU	Stock solution is prepared at 1500 units/20 μl = 75000 units/ml in distilled water.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate	GIBCO-Invitrogen	10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size	Nalgene	568-0020
Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 µm Pore Size	Nalgene	569-0020
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO-Invitrogen	26140-079
Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09–0.12 mm, No. 0	Carolina	633017
GlutaMAX-I	GIBCO-Invitrogen	35050-061
Hanks' Balanced Salts	Sigma-Aldrich	H2387-10X
HEPES, ≥99.5% (titration)	Sigma-Aldrich	H3375-250G
Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent	Sigma-Aldrich	258148-100 ML
Insulin	Sigma-Aldrich	I5500-250 mg
Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4•(7H2O), BioUltra, ≥99.5% (Fluka)	Sigma-Aldrich	63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free	BD Biosciences	356237	This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20°C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4°C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.
Minimum Essential Medium (MEM)	GIBCO-Invitrogen	51200-038
MITO+ Serum Extender, 5 ml	BD Biosciences	355006
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate	BD falcon	353047
Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate	BD falcon	353046
Neurobasal-A Medium (1X), liquid	GIBCO-Invitrogen	10888-022
Nitric Acid	VWR	bdh 3044
NS (Neuronal Supplement) 21	prepared in the lab		Source: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾”	Fisher	13-678-6A	Use this cotton-plugged 5 ¾” Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.
Pasteur pipets, 9”	Fisher	13-678-6B
Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, ≥99.0%	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Serological pipet, 2 ml	BD falcon	357507
Serological pipet, 5 ml	BD falcon	357543
Serological pipet, 10 ml	BD falcon	357551
Serological pipet, 25 ml	BD falcon	357525
Serological pipet, 50 ml	BD falcon	357550
Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	S6297-250G
Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, ≥99.5%	Sigma-Aldrich	S7653-250G
Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis	Sigma-Aldrich	480878-250G
Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4•(7H2O)), ≥99.99%, Aldrich	Sigma-Aldrich	431478-250G
Sucrose, SigmaUltra, ≥99.5% (GC)	Sigma-Aldrich	S7903-250G
Syringe filter, sterile, 0.2 µm	Corning	431219
Syringe, 3 ml	BD falcon	309585
Transferrin, Holo, bovine plasma	Calbiochem	616420
Trypan Blue stain, 0.4%	GIBCO-Invitrogen	T10282	This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (e.g. several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.
Trypsin, type XI	Sigma-Aldrich	T1005-5G
Trypsin-EDTA solution, 0.25%	GIBCO-Invitrogen	25200-056
Uridine	Sigma-Aldrich	U3003-5G	Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2'-deoxyuridine and 125-mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).
REAGENTS – immunocytochemistry
Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2	Merck Millipore	AB5622
Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail	Merck Millipore	NE1015