طلب خلايا واحدة والأجنة واحدة في 3D الحبس: جهاز جديد لفحص المحتوى العالي
Summary
نحن الإبلاغ عن الجهاز وطريقة جديدة لدراسة الخلايا والأجنة. الخلايا وحيدة هي أمر بالضبط في صفائف microcavity. من الحبس 3D هو خطوة نحو بيئات 3D التي واجهتها في الظروف الفسيولوجية ويسمح التوجه عضية. من خلال التحكم في شكل الخلية، وهذا الإعداد يقلل من التغيرات المبلغ عنها في فحوصات القياسية.
Abstract
وعادة ما تكون لوحظ الخلايا البيولوجية في (2D) الأسطح المسطحة. هذا الشرط غير الفسيولوجية، والظواهر والأشكال تختلف اختلافا كبيرا. الفرز على أساس الخلايا في مثل هذه البيئات لديها قصور بالتالي خطيرة: عضيات الخلية تظهر الظواهر المتطرفة، الأشكال التضاريسية خلية والأحجام هي عضيات الخلية غير متجانسة و / أو محددة لا يمكن تصور بشكل صحيح. وبالإضافة إلى ذلك، توجد خلايا في الجسم الحي في بيئة 3D. في هذه الحالة، خلايا تظهر الظواهر المختلفة وذلك أساسا بسبب تفاعلها مع المحيط المصفوفة خارج الخلية من الأنسجة. من أجل توحيد وتوليد ترتيب الخلايا وحيدة في بيئة 3D من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة لفحوصات خلية القاعدة، ونحن التقرير هنا التصنيع الدقيق وتطبيقات جهاز لفي المختبر زراعة الخلايا 3D. ويتكون هذا الجهاز من مجموعة 2D من microcavities (عادة 10 5 تجاويف / سم 2)، مليئة الخلايا واحد أو الأجنة لكل منهما. POSI خليةنشوئها، والشكل، والاستقطاب وتنظيم الخلايا الداخلية أصبحت ثم تطبيع تظهر بنية 3D. كنا صب متماثلة إلى نمط مجموعة من microcavities، (PDMS) طبقة "eggcups"، على لثنائي ميثيل بولي سيلوكسان رقيقة الالتزام على ساترة. كانت مغطاة تجاويف مع فبرونيكتين لتسهيل التصاق. تم إدراج الخلايا بواسطة الطرد المركزي. تم تحسين نسبة الملء لكل نظام والسماح لتصل إلى 80٪. وأكد الخلايا والأجنة جدوى. طبقنا هذه المنهجية لتصور من العضيات الخلوية، مثل جهاز نواة وجولجي، ودراسة العمليات النشطة، مثل إغلاق حلقة cytokinetic خلال الانقسام الخلوي. يسمح هذا الجهاز تحديد من الميزات الجديدة، مثل التراكمات الدورية وعدم تجانس من الميوسين والأكتين خلال إغلاق حلقة cytokinetic والظواهر المتراصة لجولجي والمواءمة النواة. نحن ميزت طريقة لخلايا الثدييات، الانشطار الخميرة، في مهدها الخميرة، C. ايليجانس ثإيث التكيف المحددة في كل حالة. وأخيرا، وخصائص هذا الجهاز تجعل من اهتمام بوجه خاص لفحوصات فحص المخدرات والطب الشخصي.
Introduction
الحالي في المقايسات خلية مقرها المختبر هما ثنائي الأبعاد (2D). هذا التكوين غير الطبيعي لخلايا الثدييات، وبالتالي ليست ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية 1؛ تظهر خلايا مجموعة متنوعة من الأشكال والأحجام والظواهر غير المتجانسة. ما يقدمونه قيود خطيرة إضافية عند تطبيقها على الطلبات الفرز، مثل توزيع المختلين داخل الطائرة والظواهر المتطرفة من العضيات الخلوية (ألياف الإجهاد، وعلى وجه الخصوص). هذا مهم بشكل خاص في التجارب السريرية لاختبار المخدرات، حيث يتم إنفاق الميزانيات الكبيرة كل عام. معظم هذه الأدوية تفشل على الرغم من عند تطبيقها على النماذج الحيوانية بسبب حالة الثقافة 2D الاصطناعية في المراحل المبكرة من فحص المخدرات. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام هذا النهج، عضيات الخلية المحددة لا يمكن تصور صحيح، مثل حلقة أكتوميوزين cytokinetic خلال الانقسام الخلوي، وعموما الهياكل التي تتطور في الطائرة عموديا على مستوى المراقبة. بعضوقد اقترحت المقايسات 2D جديدة من أجل التغلب وقد لوحظ السلبيات المذكورة أعلاه ومعلومات هامة لتنظيم الهيكل الخلوي 2،3. ومع ذلك، هذه المقايسات لا تزال موجودة واحد قيدا خطيرا: تظهر خلايا النمط الظاهري انتشارها جدا على عكس ما لوحظ في الجسم الحي، حيث تظهر خلايا بنية 3D. هذه القطع الأثرية المرتبطة مع أسلوب الثقافة قد يؤدي الميزات غير الفسيولوجية مثل ألياف الإجهاد تعزيز 1،4،5.
توفر ثلاثي الأبعاد تجارب زراعة الخلية مزايا متعددة بالمقارنة مع 2D بيئات 6،7. فهي من الناحية الفسيولوجية أكثر أهمية، والنتائج هي بالتالي ذات مغزى. وكمثال على ذلك، فإن الخلايا جزءا لا يتجزأ من الهلاميات المائية تظهر هياكل تشبه 3D ولكن الأشكال التضاريسية التي تختلف من خلية واحدة إلى 8،9 آخر. ومع ذلك، الأشكال التضاريسية التي تختلف من خلية واحدة إلى أخرى، مما يعقد التطبيقات الفرز. استراتيجية بديلة هو تضمين واحدالخلايا في تجاويف microfabricated 10،11. موقف الخلية، والشكل، والاستقطاب وتنظيم الخلايا الداخلية يمكن أن تصبح ثم تطبيع. وإلى جانب توفير بنية تشبه 3D إلى الخلايا، microcavities كما يسمح للدراسات فحص عالية المحتوى 10،12-14. الخلايا وحيدة يمكن أن يؤمر في المجهرية والعضيات الخلوية والتطورات التي يمكن ملاحظتها بشكل متواز. يوفر هذا الانتظام إحصاءات جيدة مع انخفاض عدد الخلايا وقرارات الزمنية / المكانية أفضل. مركبات مفيدة هي أسهل لتحديد موثوق.
في هذه الدراسة، نقدم لك مجموعة من تلفيق وتطبيق نظام جديد ثقافة الخلايا وحيدة مثل 3D للتطبيقات عالية المحتوى الفرز 10،12،13. يتكون الجهاز من مجموعة من microcavities من اللدائن المرنة (10 5 تجاويف / سم 2)، صاغ "eggcups" (EC). هي الأمثل الأبعاد والحجم الكلي للالمفوضية الأوروبية في هذا العمل إلى حجم نموذجي للخلايا NIH3T3 وهيلا الفرديةأثناء انقسام الخلية. يتم تحديد لتوجيه صحيح شكل خلية لتصور من العمليات النشطة – التشكل من تسوس الأسنان – أسطواني. يستخدم صب متماثلة إلى نمط مجموعة من المفوضية الأوروبية في الصعود إلى ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان رقيقة (PDMS) طبقة الالتزام على الزجاج ساترة 15،16. يتم إدخال الخلايا في المفوضية الأوروبية عن طريق الطرد المركزي. نحن هنا التقرير المراقبة وتطبيع العضيات الخلوية (ألياف الأكتين الإجهاد، جهاز جولجي والنواة) في 3D (EC) مقارنة مع نفس الخلايا على 2D (شقة) السطوح. نحن أيضا الإبلاغ عن مراقبة العمليات الديناميكية النشطة مثل إغلاق حلقة أكتوميوزين cytokinetic خلال خلية الانقسام 17. وأخيرا، وتبين لنا نتائج هذه المنهجية على أنظمة أخرى مع الجدران الصلبة، مثل مهدها الخميرة، الخميرة الانشطار وC. الأجنة ايليجانس التي تؤكد انطباق منهجية لدينا مجموعة واسعة من أنظمة نموذجية.
نقدم المقبل لص مفصل وشاملrotocol من أجل افتعال وتطبيق "eggcups" لالتصنيع الدقيق 3D. نهجنا هو بسيط ولا يحتاج إلى غرفة نظيفة. ونحن نتوقع أن هذه المنهجية الجديدة ستكون مثيرة للاهتمام بشكل خاص لفحوصات فحص المخدرات والطب الشخصي، في استبدال أطباق بتري. وأخيرا، سوف يكون لدينا جهاز مفيد لدراسة توزيع استجابات الخلايا للمؤثرات الخارجية، على سبيل المثال في سرطان 18 أو في البحوث الأساسية 19.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدم صب متماثلة من أجل افتعال "eggcups". عملية التصنيع لا يحتاج إلى غرفة نظيفة. فمن السهل والبسيط، على الرغم من بعض الممارسات قد تكون مطلوبة. على وجه الخصوص، والإفراج عن طابع PDMS هي الخطوة الأكثر أهمية من أجل إنتاج مساحة واسعة من جودة عالية "eggcups". لهذا السبب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نعترف L. Brino (IGBMC العليا منشأة فحص المحتوى، إلكيرش، فرنسا) لتزويدنا الأجسام المضادة لمكافحة Giantin، M. Labouesse مختبر. لC. ايليجانس (IGBMC) وباء. Séraphin مختبر. لفي مهدها الخميرة (IGBMC)، E. Paluch وA. هيمان لالفلورسنت خلايا هيلا (MPI-CBG، درسدن)، J. موسلي (كلية الطب في دارتموث) وJQ وو (جامعة ولاية أوهايو) للخلايا الخميرة الانشطار. A. هويل وواو Evenou لمساعدة التجريبية، C. ريك (IBMC، ستراسبورغ، فرنسا) للحصول على المساعدة التقنية، وJC جينوت (فيمتو-الحادي وفرنسا) للمساعدة في التصنيع الدقيق. وأيد هذا العمل من جانب صناديق من CNRS، جامعة ستراسبورغ، Conectus، لا مؤسسة صب لا بحوث ميديكال وCI-الثورى لفتح ستراسبورغ.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ddH20 (ultrapure) | Millipore | – | Use always fresh water. |
| Parafilm (plastic film) | Bemis | PM-999 | Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness. |
| Photo-mask | Selba | – | http://www.selba.ch |
| Silicon wafer | Siltronix | – | http://www.siltronix.com/ |
| SU-8 photoresist | MicroChem | 2000 series | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| SU-8 developer | MicroChem | – | http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information | |||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 19030 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en®ion=CA |
| Available from multiple companies. | |||
| Sigmacote (siliconizing reagent ) | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr®ion=FR |
| harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Chlorotrimethylsilane (TMCS) | Sigma-Aldrich | 386529-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR |
| TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition | |||
| Nitrile gloves | Kleenguard | 57372 | http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m |
| Available from multiple companies. | |||
| Glass coverslips #0 | Knittel glass | KN00010022593 | http://www.knittelglass.com/index_e.htm |
| Very fragile. Manipulate gently. | |||
| Sharp straight tweezers | SPI | 0WSSS-XD | http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp |
| Available from multiple companies. | |||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN |
| The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies. | |||
| Microscope glass slides | Dutscher | 100001 | http://www.dutscher.com/frontoffice/search |
| Available from multiple companies. | |||
| DMEM high-glucose medium | Fisher Scientific | 41965-039 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Bovine calf serum | Sigma-Aldrich | C8056-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en®ion=CA |
| 0,25% Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25200-072 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS 1X | Fisher Scientific | 14200-067 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS is at 10X and should be diluted to 1X using ddH2O | |||
| L-15 medium | Fisher Scientific | 21083-027 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Medium for atmospheres without CO2 control | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Penicillin & Streptomycin | Fisher Scientific | 15140-122 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM |
| Petri dish P35 | Greiner | 627102 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/ |
| Petri dish P60 | Greiner | 628163 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/ |
| Petri dish P94 | Greiner | 633179 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/ |
| Paraformaldehyde 3 % | Sigma-Aldrich | P6148-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr®ion=FR |
| Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Triton 0.5 % | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 | InVitrogen | A12379 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 |
| dissolve powder in 1.5 ml methanol | |||
| Alexa Fluor 647 | InVitrogen | A21245 | 1:200 dilution in PBS 1X |
| rabbit polyclonal anti-Giantin | Abcam | ab24586 | 1:500 dilution in PBS 1X |
| http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html | |||
| rabbit anti-anillin | Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). | 1:500 dilution in PBS 1X | |
| Anti-phosphotyrosine | Transduction Lab | 610000 | http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 |
| Cy3 goat anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 111-166-047 | http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp |
| 1:1000 dilution in PBS 1X | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr®ion=FR |
| 1 mg/ml for 1 min | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| HeLa cells | – | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| NIH3T3 cells | ATCC | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| Fission yeast | – | – | For details on strains, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| C. elegans worms | – | – | For details, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| YES (Agar) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-732 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| YES (Media) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-522 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search |
| For preparation: follow the instructions as given on the box | |||
| EMM (Media) | MP Biomedicals | 4110-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| Filter sterilized EMM (Media) – Only for imaging | MP Biomedicals | 4110-012 | For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence. |
| Supplements (for EMM) | MP Biomedicals | 4104-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search |
| (Add 225mg/l into the EMM media before autoclaving or filtering) | |||
| Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters | Millipore | – | http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2 |
References
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009).
- Mandal, K., Balland, M., Bureau, L. Thermoresponsive Micropatterned Substrates for Single Cell Studies. PLoS ONE. 7, e37548 (2012).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. , (2012).
- Ghibaudo, M., Di Meglio, J. M., Hersen, P., Ladoux, B. Mechanics of cell spreading within 3D-micropatterned environments. Lab Chip. 11, 805-812 (2010).
- Greiner, A. M., Richter, B., Bastmeyer, M. Micro-Engineered 3D Scaffolds for Cell Culture Studies. Macromol Biosci. 12, 1301-1314 (2012).
- Khetan, S., et al. Degradation-mediated cellular traction directs stem cell fate in covalently crosslinked three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 12, 458-465 (2013).
- Legant, W. R., et al. Measurement of mechanical tractions exerted by cells in three-dimensional matrices. Nat Meth. 7, 969-971 (2010).
- Riveline, D., Buguin, A. . Devices and methods for observing the cell division. , (2010).
- Ochsner, M., et al. Micro-well arrays for 3D shape control and high resolution analysis of single cells. Lab Chip. 7, 1074-1077 (2007).
- Riveline, D. . Devices and methods for observing cells with cell wall or invertebrate embryos with oblong eggshell . , (2012).
- Riveline, D., Wollrab, V. . Devices and methods for observing eukaryotic cells without cell wall. , (2012).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotech. 28, 237-245 (2010).
- Wolfe, D., Qin, D., Whitesides, G., Hughes, M. P., Hoettges, K. F. Microengineering in Biotechnology, Ch 3. Methods in Molecular Biology. 583, 81-107 (2010).
- Mehling, M., Tay, S. Microfluidic cell culture. Curr Op Biotech. 25, 95-102 (2014).
- Wollrab, V., Thiagarajan, R., Wald, A., Kruse, K., Riveline, D. Still and rotating myosin clusters determine cytokinetic ring constriction. Nat Commun. 7, 11860-11869 (2016).
- Yao, X., et al. Functional analysis of single cells identifies a rare subset of circulating tumor cells with malignant traits. Integr Biol. 6, 388-398 (2014).
- Eberwine, J., Sul, J. Y., Bartfai, T., Kim, J. The promise of single-cell sequencing. Nat Meth. 11, 25-27 (2014).
- Allen, T. D., et al. Generation of cell-free extracts of Xenopus eggs and demembranated sperm chromatin for the assembly and isolation of in vitro-formed nuclei for Western blotting and scanning electron microscopy (SEM). Nat. Protocols. 2, 1173-1179 (2007).
- Robbins, E., Marcus, P. I. Mitotically Synchronized Mammalian Cells: a Simple Method for Obtaining Large Populations. Science. 144, (1964).
- Whitfield, M. L., et al. Stem-loop binding protein, the protein that binds the 3" end of histone mRNA, is cell cycle regulated by both translational and posttranslational mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 20, (2000).
- Straight, A. F., et al. Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor. Science. 299, 1743-1747 (2003).
- Tang, J., Erikson, R. L., Liu, X. Checkpoint kinase 1 (Chk1) is required for mitotic progression through negative regulation of polo-like kinase 1 (Plk1). Proc Natl Acad Sci. 103, 11964-11969 (2006).
- Zahreddine, H., Zhang, H., Diogon, M., Nagamatsu, Y., Labouesse, M. CRT-1/Calreticulin and the E3 Ligase EEL-1/HUWE1 Control Hemidesmosome Maturation in C. elegans Development. Curr Biol. 20, 322-327 (2010).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. JoVE. , e4019 (2012).
- Saha, S., Pollard, T. D. Anillin-related protein Mid1p coordinates the assembly of the cytokinetic contractile ring in fission yeast. Mol Biol Cell. 23, 3982-3992 (2012).
- Prestwich, G. D. Evaluating Drug Efficacy and Toxicology in Three Dimensions: Using Synthetic Extracellular Matrices in Drug Discovery. Acc Chem Res. 41, 139-148 (2007).
- Futamura, Y., et al. Morphobase, an Encyclopedic Cell Morphology Database, and Its Use for Drug Target Identification. Chem Biol. 19, 1620-1630 (2012).
