우리는 세포와 배아를 연구하는 장치와 새로운 방법을보고합니다. 단일 세포는 정확하게 마이크로 공동 어레이에 정렬됩니다. 그들의 3D 감금은 생리 학적 조건에서 발생하는 3D 환경을 향한 단계이며 소기관 방향을 수 있습니다. 세포의 모양을 제어함으로써,이 설정은 표준 분석에보고 된 변동성을 최소화 할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
생물 세포는 일반적으로 평면 (2D) 표면에서 관찰된다. 이 조건은 생리적없고, 표현형 및 모양이 매우 다양하다. 이러한 환경에서 세포 기반 스크리닝 따라서 심각한 한계를 가지고 : 세포 소기관은 이종 및 / 또는 특정 세포 소기관이 제대로 시각화 할 수없는 극단적 인 표현형, 세포의 형태 학적 및 크기를 표시합니다. 또한, 생체 내의 세포는 3 차원 환경에서의 위치; 이 상황에서, 세포는 주로하기 때문에 조직의 주변 세포 외 기질과의 상호 작용의 서로 다른 표현형을 보여줍니다. 표준화 및 세포 기반 검정을위한 생리 학적으로 관련 차원 환경에서 하나의 셀의 순서를 생성하기 위해, 여기에서 3D 관내 세포 배양 장치의 미세 가공 및 애플리케이션을보고한다. 이 장치는 마이크로 공동의 2 차원 배열 (일반적으로 10 5 공동 / cm 2), 단일 세포 또는 배아로 가득 각각 구성되어있다. 셀 포지기, 모양, 극성 및 내부 세포 조직은 3 차원 구조를 보여주는 다음 정규화된다. 우리는 커버 슬립에 부착 된 얇은 폴리 디메틸 실록산 상 'eggcups'(PDMS) 층 패턴 마이크로 공동의 배열을 복제 성형을 사용했다. 캐비티가 접착을 촉진하기 피브로넥틴으로 피복 하였다. 균체를 원심 분리에 의해 삽입 하였다. 충전 비율을 80 %까지 허용하는 각 시스템에 대해 최적화되었다. 배아 세포 생존이 확인되었다. 우리는 핵 및 골지 장치와 같은 세포 소기관의 시각화를 위해이 방법을 적용, 이러한 세포 유사 분열 동안 cytokinetic 반지의 폐쇄 활성 프로세스를 연구. 이 장치는 골지체와 핵 정렬에 대한 cytokinetic 링 폐쇄 및 압축 된 표현형 중에 이러한주기적인 축적과 미오신과 액틴의 불균질성과 같은 새로운 기능의 식별을 허용했다. 우리는 포유류 세포, 분열 효모, 출아 효모, C.하는 방법을 특징으로하는 엘레 w각각의 경우에 i 번째 특정 적응. 마지막으로,이 장치의 특성은 약물 스크리닝 분석 및 맞춤 의학에 특히 흥미합니다.
서론
시험 관내 세포 - 기반 검정에서의 전류 (2D) 이차원이다. 이 구성은 포유 동물 세포에 대한 자연 아니므 한 생리 관련이 없다; 세포 모양, 크기 및 이기종 표현형의 다양성을 보여줍니다. 같은 비행기 및 세포 소기관의 극단적 인 표현형 (특히 스트레스 섬유) 내에서 무질서한 분포로, 심사 응용 프로그램에 적용 할 때 그들은 추가 심각한 한계를 제시한다. 이는 높은 예산이 매년 소비되는 약물 검사에 대한 임상 시험에서 특히 중요하다. 때문에 약물 검사의 초기 단계에서 인공 2D 문화 조건의 동물 모델에 적용 할 때이 약의 대부분은 비록 실패합니다. 또한,이 방법을 이용하여 특정 세포 소기관 적절 통상 관찰의 평면에 수직 한 평면에서 진화 구조 같은 세포 분열 동안 cytokinetic 액토 마이 오신 고리로서 가시화 될 수 없다. 약간새로운 2 차원 분석은 세포 골격 조직에서 상술 한 단점 중요한 통계는 2,3- 관찰되었다 극복하기 위해 제안되었다. 그러나 이러한 분석은 여전히 존재 하나 심각한 제한 : 세포는 세포가 3 차원 구조를 제시 생체 내에서 관찰되는 것과 대조적으로 매우 확산 표현형을 나타낸다. 배양 방법과 관련이 유물은 강화 된 스트레스 섬유 1,4,5으로 비 생리적 기....
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프로토콜
'Eggcups'의 1 미세
- 마스터의 제작 : 마이크로 공동 배열
- 습도 중 존재를 증발시켜 200 ° C로 3 '실리콘 웨이퍼를 가열한다.
- 스핀 코트 SU-8 포토 레지스트의 박층. 원하는 두께와 포토 레지스트 타입에 따라 수지와 방사 속도의 볼륨을 조정한다. 이 두께는 'eggcups'(EC)의 깊이를 지시한다. 2,800 rpm에서 30 μm의 두께 층과 SU-8 2025, 스핀 코트하십시오.
- 사전 빵을 30 μm의 두께 SU-8 2025 층 1 분 (2 단계 1) 65 ° C에서 웨이퍼. 바람직한 포토 레지스트의 종류와 두께에 따라 시간을 적응. 자세한 내용은 제조업체의 데이터 시트를 확인합니다.
- 사전 빵을 30 μm의 두께 SU-8 2025 층 3 분 (2의 2 단계) 95 ° C에서 웨이퍼. 바람직한 포토 레지스트의 종류와 두께에 따라 시간을 적응. 자세한 내용은 제조업체의 데이터 시트를 확인합니다.
- 로드UV 노광용 마스크 얼 라이너 용 웨이퍼. 그것에 포토 리소그래피 마스크를 놓습니다. 마스크는 직경 20 ㎛, 순환 기능 (디스크)의 패턴을 보여줍니다. 서로 간의 완벽한 접촉을 확인합니다.
참고 : 다른 제조업체가 포토 리소그....
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결과
'eggcups'(EC)는 3 차원 환경에서 배향 배아 세포의 가시화를 허용하는 신규 한 고 함량의 스크리닝 방법이다. 또한, 표준 2 차원 (평면) 배양 물에서 관찰하기 어려운 몇몇 세포 과정은이 새로운 방법에 의해 관찰 할 수있다.도 1a (제 1 전술 한 프로토콜도 참조 EC 미세 가공하기위한 절차의 개요를 나타낸다 ). 상기 방법은도 1B. 간단한 빠르고 효율적인 특수 장비의 필요없이 임의이며 1c는 대형 포토 각각 'eggcups'의 확대 된 주사 전자 현미경 이미지를 나타낸다. 이 관찰 될 수있는 바와 같이, 그 형상 및 크기가 매우 규칙적. 이 방법은 매우 유연; 다른 모양 및 크기를 쉽게 제조되고 다른 모델 시스템에 적용될 수있다. 'eggcups'의 치수는 다음과 같이 선택되었다 : 치수이들이 구형 있고 그 직경은 EC 직경에 대한 좋은 지표로 하였다 : 분열을 거쳐 세포의 2D 표면 상에 측정 하였다. 예를 들어 세포 .......
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토론
복제 성형은 'eggcups'를 제조하기 위해 사용 하였다. 제조 공정은 클린 룸을 필요로하지 않는다; 연습이 필요할 수 있지만 그것은 쉽고 간단합니다. 특히, PDMS 스탬프을 떼면 고품질 'eggcups'의 넓은 영역을 생성하기 위해 가장 중요한 단계이다. 이 때문에, 특별한주의가이 단계에서 수행되어야한다. 이 단계를 반복하여 실패한 경우, 실란 화 플라즈마 결합 전에 플라즈마 클리너 파라미터를 최적화하기 위해 고려한다. 부족 실란 화는 PDMS 필름에 스탬프의 강한 고집으로 이어질 것입니다. 이 관찰되면 silanizing 시약 배양 시간이 증가 될 수있다. 다른 기술 및 물질 리간드 (피브로넥틴, 젤라틴, 콜라겐, 등)의 넓은 범위에 작용 화 될 수있는 'eggcups'를 제조하는데 적용될 수 있다는 것을 유의하여야한다. 특히 폴리스티렌 마이크로 공동 용이 CUS 의해 제조 될 수있다핫 엠보싱 기술을 톰-했다. 이 표준 배양 접시에서 얻어진 결과 생체 적합성과 .......
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공개 사항
우리는 공개 할게 없다.
감사의 글
우리는 안티 Giantin 항체, M. Labouesse 랩으로 우리를 제공하기위한 L. Brino (IGBMC 높은 콘텐츠 상영 시설하여 Illkirch, 프랑스)을 인정합니다. C.에 대한 간스 (IGBMC)와 B Séraphin 연구소. 효모 (IGBMC), 분열 효모 세포에 대한 형광 HeLa 세포 (MPI-CBG, 드레스덴), J. 모슬리 (다트머스 의과 대학)와 JQ 우 (오하이오 주립 대학)에 대한 E. Paluch 및 A. 하이 먼 신진에 대한; A. Hoël과 실험 도움 F. Evenou, 기술 지원을위한 C. 릭 (IBMC, 스트라스부르, 프랑스), 및 미세에 도움 JC Jeannot (펨토 - 일, 프랑스). 이 작품은 CNRS, 스트라스부르 대학, Conectus에서 기금에 의해 지원되었다, 라 파운데이션 부문은 라 공들인 MEDICALE와 스트라스부르의 CI-FRC를 붓는다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| ddH20 (ultrapure) | Millipore | - | 항상 신선한 물을 사용하십시오. |
| 파라 필름 (플라스틱 필름) | Bemis | PM-999 | 물방울을 사용하여 실험실 벤치에 파라 필름을 부착하고 완벽한 표면 평탄도를 보장합니다. |
| 포토 마스크 | Selba | - | http://www.selba.ch |
| 실리콘 웨이퍼 | Siltronix | - | http://www.siltronix.com/ |
| SU-8 포토레지스트 | MicroChem | 2000 series | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| 연기 속에서 작업이 필요합니다. 자세한 내용은 제조업체의 데이터 시트를 확인하십시오. | |||
| SU-8 개발자 | MicroChem | - | http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm |
| 연기 속에서 작업하는 것이 필요합니다; 자세한 정보는 | |||
| 2-프로판올 | Sigma-Aldrich | 19030 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en& region=CA |
| 여러 회사에서 사용할 수 있습니다. | |||
| Sigmacote (실리콘화 시약) | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr& 지역=FR |
| 해로운, 연기 속에서 작업하는 것이 필요합니다. 자세한 내용은 제조업체의 데이터 시트를 확인하십시오. | |||
| 클로로 트리메틸 실란 (TMCS) | 시그마 - 알드리치 | 386529-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR |
| TMCS는 급성 흡입 및 피부 독성을 일으키며 가연성이 높으므로(상당한 거리에서 점화 역화가 발생할 수 있음) 따라서 점화원에서 떨어진 흄 찬장에서 사용해야 합니다 | |||
| 니트릴 장갑 | Kleenguard | 57372 | http://www.kcprofessional. com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m |
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| 유리 커버슬립 #0 | 니트텔 유리 | KN00010022593 | http://www.knittelglass.com/index_e.htm |
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| 샤프 스트레이트 핀셋 | SPI | 0WSSS-XD | http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 |
| 50ml 튜브 | BD Falcon | 352070 | http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp |
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| PDMS | 다우 코닝 | 실가드 184 키트 | http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx? R=131EN |
| 패키지에는 PDMS 베이스와 경화제가 모두 포함되어 있습니다. 유사한 엘라스토머는 여러 회사에서 사용할 수 있습니다. | |||
| 현미경 유리 슬라이드 | Dutscher | 100001 | http://www.dutscher.com/frontoffice/search |
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| DMEM 고혈당 매체 | Fisher Scientific | 41965-039 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search? LBCID=12301479& 키워드=41965-039& store=과학& 나비=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD |
| 소 송아지 혈청 | Sigma-Aldrich | C8056-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en& region=CA |
| 0.25% 트립신-EDTA | 피셔 사이언티픽 | 25200-072 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072& store=과학& 나비=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD |
| PBS 1x | 피셔 사이언티픽 | 14200-067 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067& store=과학& 나비=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD |
| PBS는 10배이며 ddH2O | |||
| L-15 medium | Fisher Scientific | 21083-027 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027& store=과학& 나비=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD |
| CO2 제어 | |||
| Fibronectin이 없는 대기용 매체 | 시그마-알드리치 | F1141-5MG | a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& 기간=F1141-5MG& 언어=ko& 지역=CA& focus=제품& N=0+220003048+219853082+219853286& 모드 = match % 20partialmax ">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& 기간=F1141-5MG& 언어=ko& 지역=CA& focus=제품& N=0+220003048+219853082+219853286& 모드 = match % 20partialmax < / a > |
| 페니실린 & 스트렙토마이신 | 피셔 사이언티픽 | 15140-122 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122& store=과학& 나비=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=CHEM |
| 페트리 접시 P35 | Greiner | 627102http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/ | |
| 페트리 접시 P60 | Greiner | 628163 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/ |
| 페트리 접시 P94 | Greiner | 633179 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/ |
| 파라포름알데히드 3 % | Sigma-Aldrich | P6148-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr& 지역=FR |
| 특히 눈에 해롭기 때문에 연기 속에서 작업해야 합니다. 자세한 내용은 제조업체의 데이터 시트를 확인하십시오. | |||
| 트리톤 0.5 % | 시그마-알드리치 | 93443-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& 기간=93443-100ML& 언어=ko& 지역=CA& focus=제품& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax |
| Phallodin-Green 형광 Alexa Fluor 488 | InVitrogen | A12379 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379? CID=검색-a12379 |
| 1.5 ml 메탄올 | |||
| Alexa Fluor 647 | InVitrogen | A21245 | 1:200 PBS에 있는 희석 1x |
| 토끼 polyclonal anti-Giantin | Abcam | ab24586 | 1:500 PBS에 있는 희석 1x |
| http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html 에 있는 분말을 녹입니다; | |||
| rabbit anti-anillin | Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin은 사이토키네시스(cytokinesis) 동안 RhoA, actin 및 myosin을 연결하는 골격 단백질입니다. 현재 생물학 18, 30– 6 (2008년). | PBS 1x | |
| Anti-phosphotyrosine | Transduction Lab | 610000 | |
| http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 Cy3 염소 anti-rabbit | 잭슨 면역 연구 | 111-166-047 | http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp |
| 1:1,000 희석, PBS 1x | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr& 지역=FR 1 |
| 1mg/ml | |||
| 글리세롤 | 시그마-알드리치 | G2025 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& 기간=G2025& 언어=ko& 지역=CA& focus=제품& N=0+220003048+219853082+219853286& 모드 = match % 20partialmax < / a > |
| 미네랄 오일 | Sigma-Aldrich | M8410-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& 기간=M8410-500ML& 언어=ko& 지역=CA& focus=제품& N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax |
| HeLa 세포 | - | - | 포유류 세포는 많은 회사에서 구할 수 있습니다. Table 1 |
| NIH3T3 세포 | ATCC- | 포유류 세포는 많은 회사에서 구할 수 있습니다. Table 1 | |
| Fission yeast 참조. | - | - | 균주에 대한 자세한 내용은 교신저자에게문의하십시오. Table 1 |
| C. elegans worms | - | - | 자세한 내용은 교신 저자에게나 연락하시기 바랍니다. 참조 표 1 |
| YES (한천) + 5 보충제 포함 | MP Biomedicals | 4101-732 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732& s=검색 |
| 준비를 위해: 상자에 | |||
| YES (미디어) + 5개의 보충제 포함 | MP Biomedicals | 4101-522 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522& s=검색 |
| 준비: EMM | |||
| (미디어) | MP Biomedicals | 4110-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012& s=검색 >< |
| 준비: 상자에 | |||
| 필터 멸균 EMM (미디어) - MP | Biomedicals | 4110-012 | . 준비: 상자에 적힌 지시사항을 따르십시오. 필터는 0.22 µ를 사용하여 매체를 살균합니다. 오토클레이브 대신 M 필터를 사용합니다. 이것은 매체에 투명도를 제공하고 자가형광을 감소시킵니다. |
| 보충제 (EMM용) | MP Biomedicals | 4104-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012& s=검색 |
| ( 오토클레이브 또는 여과 전에 EMM 매체에 225 mg/L를 추가하십시오) | |||
| Stericup 및 Steritop 진공 구동 멸균 필터 | Millipore | - | http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare& 탭1=2& 탭2=1#탭2=1:탭1=2 |
참고문헌
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009)....
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