एकल कक्षों और 3 डी कारावास में एकल भ्रूण आदेश: उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए एक नई डिवाइस
Summary
हम एक डिवाइस और एक नई विधि कोशिकाओं और भ्रूण का अध्ययन करने के लिए रिपोर्ट। एकल कक्षों ठीक microcavity सरणियों में आदेश दिए हैं। उनके 3 डी कारावास 3 डी वातावरण शारीरिक स्थितियों में सामना करने की दिशा में एक कदम है और organelle उन्मुखीकरण अनुमति देता है। सेल आकार को नियंत्रित करके, इस स्थापना परिवर्तनशीलता मानक assays में सूचना को कम करता है।
Abstract
जैविक कोशिकाओं आमतौर पर फ्लैट (2 डी) सतहों मनाया जाता है। इस हालत शारीरिक नहीं है, और phenotypes और आकार अत्यधिक चर रहे हैं। ऐसे वातावरण में कोशिकाओं पर आधारित स्क्रीनिंग इसलिए गंभीर सीमाएं हैं: सेल organelles चरम phenotypes, सेल morphologies और आकार दिखा रहे हैं विषम और / या विशेष सेल अंगों को ठीक से कल्पना नहीं की जा सकती है। इसके अलावा, विवो में कोशिकाओं एक 3 डी वातावरण में स्थित हैं; इस स्थिति में, कोशिकाओं को मुख्य रूप से ऊतक के आसपास के बाह्य मैट्रिक्स के साथ उनकी बातचीत की वजह से अलग phenotypes दिखा। आदेश मानकीकरण और सेल आधारित assays के लिए एक physiologically प्रासंगिक 3 डी वातावरण में एकल कक्षों के क्रम में उत्पन्न करने में, हम यहाँ इन विट्रो 3 डी सेल संस्कृति के लिए microfabrication और एक डिवाइस के आवेदनों की रिपोर्ट। इस डिवाइस microcavities की एक 2 डी सरणी (आमतौर पर 10 5 गुहाओं / 2 सेमी), एकल कक्षों या भ्रूण के साथ भरा प्रत्येक के होते हैं। सेल posiमोर्चे, आकार, polarity और आंतरिक सेल संगठन एक 3 डी वास्तुकला दिखा तो सामान्यीकृत हो जाते हैं। हम पैटर्न के लिए microcavities की एक सरणी प्रतिकृति ढलाई के लिए इस्तेमाल किया, 'eggcups', एक पतली polydimethylsiloxane पर (PDMS) परत एक coverslip पर पालन। Cavities आसंजन की सुविधा के लिए fibronectin के साथ कवर किया गया। प्रकोष्ठों centrifugation द्वारा डाला गया। भरने प्रतिशत प्रत्येक प्रणाली में 80% तक की अनुमति के लिए अनुकूलित किया गया था। कोशिकाओं और भ्रूण व्यवहार्यता की पुष्टि की थी। हम इस तरह के नाभिक और Golgi उपकरण के रूप में सेलुलर अंगों, के दृश्य के लिए इस पद्धति लागू है, और इस तरह के सेल बँटवारा दौरान cytokinetic अंगूठी के बंद होने के रूप में सक्रिय प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए। इस डिवाइस cytokinetic अंगूठी बंद करने और Golgi और नाभिक संरेखण के लिए ठोस phenotypes के दौरान इस तरह समय-समय पर राशि और मायोसिन और actin के inhomogeneities के रूप में नई सुविधाओं, की पहचान करने की अनुमति दी। हम स्तनधारी कोशिकाओं, विखंडन खमीर, नवोदित खमीर, सी के लिए विधि की विशेषता एलिगेंस wप्रत्येक मामले में ith विशिष्ट अनुकूलन। अंत में, इस डिवाइस की विशेषताओं यह विशेष रूप से दवा स्क्रीनिंग assays और व्यक्तिगत दवा के लिए रोचक बना।
Introduction
इन विट्रो सेल आधारित assays में वर्तमान में दो आयामी (2 डी) कर रहे हैं। यह विन्यास स्तनधारी कोशिकाओं के लिए प्राकृतिक नहीं है और इसलिए physiologically प्रासंगिक 1 नहीं है; कोशिकाओं आकार, आकार और विषम phenotypes की विविधता दिखाने के लिए। जब इस तरह के विमान और सेलुलर अंगों के चरम phenotypes (तनाव फाइबर, विशेष रूप से) के भीतर एक अव्यवस्थित वितरण के रूप में स्क्रीनिंग के आवेदन करने के लिए आवेदन किया है, वे अतिरिक्त गंभीर सीमाएं प्रस्तुत करते हैं। यह दवा परीक्षण, जहां उच्च बजट हर साल खर्च कर रहे हैं के लिए नैदानिक परीक्षण में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। जब दवा स्क्रीनिंग के प्रारंभिक दौर में कृत्रिम 2 डी संस्कृति हालत की वजह से पशु मॉडलों के लिए लागू इन दवाओं के अधिकांश हालांकि असफल। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, विशेष सेल अंगों को ठीक से, इस तरह के सेल बँटवारा दौरान cytokinetic actomyosin अंगूठी के रूप में कल्पना की जा सकता है, और आम तौर पर संरचनाओं कि अवलोकन के विमान को सीधा विमान में विकसित हो रहे हैं। कुछनई 2 डी assays के आदेश पर काबू पाने के लिए उपर्युक्त कमियां और cytoskeleton संगठन पर महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि 2,3 देखा गया है में प्रस्तावित किया गया है। हालांकि, इन assays अभी भी मौजूद एक गंभीर सीमा: कोशिकाओं क्या विवो, जहां कोशिकाओं एक 3 डी वास्तुकला उपस्थित में मनाया जाता है के विपरीत एक बहुत ही प्रसार phenotype दिखा। संस्कृति विधि के साथ जुड़े इन कलाकृतियों में इस तरह बढ़ाया तनाव फाइबर 1,4,5 के रूप में गैर-शारीरिक सुविधाओं को गति प्रदान कर सकते हैं।
तीन आयामी सेल संस्कृति assays के कई लाभ प्रदान करते हैं जब की तुलना में 2 डी वातावरण 6.7 करने के लिए। वे physiologically अधिक प्रासंगिक हैं, और परिणाम इसलिए सार्थक कर रहे हैं। एक उदाहरण के रूप में, हाइड्रोजेल में एम्बेडेड कोशिकाओं 3 डी संरचनाओं की तरह दिखा, लेकिन उनकी एक और morphologies 8,9 करने के लिए एक सेल से भिन्न होते हैं। हालांकि, उनके morphologies दूसरे के लिए एक सेल, जो स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों पेचीदा से भिन्न होते हैं। एक वैकल्पिक रणनीति एकल एम्बेड करने के लिए हैmicrofabricated गुहाओं 10,11 में कोशिकाओं। सेल की स्थिति, आकार, polarity और आंतरिक कोशिका संगठन तो सामान्यीकृत बन सकता है। कोशिकाओं के लिए 3 डी की तरह वास्तुकला प्रदान करने के अलावा, microcavities भी उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के अध्ययन 10,12-14 के लिए अनुमति देता है; एकल कक्षों प्रोटीन और सेलुलर अंगों में आदेश दिया जा सकता है और उनके evolutions समानांतर में मनाया जा सकता है। यह नियमितता कोशिकाओं की कम संख्या और बेहतर अस्थायी / स्थानिक संकल्प के साथ अच्छे आँकड़े प्रदान करता है। उपयोगी यौगिकों मज़बूती से पहचान करने के लिए आसान कर रहे हैं।
इस अध्ययन में, हम उच्च सामग्री स्क्रीनिंग अनुप्रयोगों 10,12,13 के लिए निर्माण और एक नया 3 डी की तरह एकल कक्षों संस्कृति प्रणाली के आवेदन दिखा। डिवाइस elastomeric microcavities (10 5 गुहाओं / 2 सेमी), गढ़ा 'eggcups' (ईसी) की एक सरणी के होते हैं। आयाम और इस काम में चुनाव आयोग की कुल मात्रा अलग-अलग NIH3T3 और हेला कोशिकाओं की खासियत मात्रा करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैंकोशिका विभाजन के दौरान। बेलनाकार – – गुहाओं की आकृति विज्ञान सक्रिय प्रक्रियाओं के दृश्य के लिए ठीक से ओरिएंट सेल आकार के लिए चयन किया जाता है। प्रतिकृति मोल्डिंग एक पतली polydimethylsiloxane (PDMS) परत एक गिलास पर पालन पर चुनाव आयोग की एक सरणी के पैटर्न के लिए प्रयोग किया जाता है coverslip 15,16। प्रकोष्ठों चुनाव आयोग में centrifugation द्वारा पेश कर रहे हैं। हम यहाँ पर एक ही 2 डी कोशिकाओं के साथ तुलना में अवलोकन और 3 डी (ईसी) में सेलुलर अंगों (actin तनाव फाइबर, Golgi तंत्र और नाभिक) को सामान्य बनाने रिपोर्ट (फ्लैट) सतहों। हम भी इस तरह के सेल बँटवारा 17 के दौरान cytokinetic actomyosin अंगूठी के बंद होने के रूप में सक्रिय dynamical प्रक्रियाओं का अवलोकन रिपोर्ट। अंत में, हम इस तरह के नवोदित खमीर, विखंडन खमीर और सी के रूप में कठोर दीवारों, के साथ अन्य प्रणालियों पर इस पद्धति के परिणाम बताते हैं एलिगेंस भ्रूण जो मॉडल प्रणाली की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए हमारी कार्यप्रणाली की प्रयोज्यता की पुष्टि करता है।
हम अगले एक विस्तृत और व्यापक पी पेशआदेश में rotocol बनाना और 3 डी microfabrication के लिए 'eggcups' लागू करने के लिए। हमारा दृष्टिकोण सरल है और एक साफ कमरे की जरूरत नहीं है। हम आशा करते हैं कि इस नई पद्धति दवा स्क्रीनिंग assays और व्यक्तिगत दवा के लिए विशेष रूप से दिलचस्प होगा पेट्री डिश के प्रतिस्थापन में। अंत में, हमारे डिवाइस कोशिकाओं प्रतिक्रियाओं का वितरण कैंसर 18 में या बुनियादी अनुसंधान 19 में उदाहरण के लिए, बाहरी उत्तेजनाओं को अध्ययन के लिए उपयोगी हो जाएगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रतिकृति मोल्डिंग आदेश 'eggcups' के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया था। निर्माण की प्रक्रिया एक साफ कमरे की जरूरत नहीं है; यह आसान और सरल है, हालांकि कुछ अभ्यास की आवश्यकता हो सकती है। विशेष रूप से, PDMS टिक…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम विरोधी Giantin एंटीबॉडी, एम Labouesse लैब के साथ हमें प्रदान करने के लिए एल Brino (IGBMC उच्च सामग्री स्क्रीनिंग की सुविधा, Illkirch, फ्रांस) स्वीकार करते हैं। सी के लिए एलिगेंस (IGBMC) और बी Séraphin लैब। खमीर (IGBMC), विखंडन खमीर कोशिकाओं के लिए फ्लोरोसेंट हेला कोशिकाओं (एमपीआई सीबीजी, ड्रेसडेन), जे Moseley (डार्टमाउथ मेडिकल स्कूल) और JQ वू (ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी) के लिए ई Paluch और ए हैमन नवोदित के लिए; ए Hoel और प्रयोगात्मक मदद के लिए एफ Evenou, तकनीकी मदद के लिए सी रिक (IBMC, स्ट्रासबर्ग, फ्रांस), और microfabrication में मदद के लिए जे.सी. Jeannot (Femto-अनुसूचित जनजाति, फ्रांस)। इस काम CNRS, स्ट्रासबर्ग विश्वविद्यालय, Conectus से धन के द्वारा समर्थित किया गया था, ला ला Recherche Fondation médicale और स्ट्रासबर्ग सीआई-एफआरसी डालना।
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ddH20 (ultrapure) | Millipore | – | Use always fresh water. |
| Parafilm (plastic film) | Bemis | PM-999 | Adhere Parafilm to the lab bench using some water droplets and ensure a perfect surface flatness. |
| Photo-mask | Selba | – | http://www.selba.ch |
| Silicon wafer | Siltronix | – | http://www.siltronix.com/ |
| SU-8 photoresist | MicroChem | 2000 series | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| SU-8 developer | MicroChem | – | http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm |
| working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information | |||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 19030 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en®ion=CA |
| Available from multiple companies. | |||
| Sigmacote (siliconizing reagent ) | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr®ion=FR |
| harmful, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Chlorotrimethylsilane (TMCS) | Sigma-Aldrich | 386529-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR |
| TMCS produces acute inhalation and dermal toxicity, and is highly flammable (with ignition flashback able to occur across considerable distances), consequently it should be used in a fume cupboard away from sources of ignition | |||
| Nitrile gloves | Kleenguard | 57372 | http://www.kcprofessional.com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m |
| Available from multiple companies. | |||
| Glass coverslips #0 | Knittel glass | KN00010022593 | http://www.knittelglass.com/index_e.htm |
| Very fragile. Manipulate gently. | |||
| Sharp straight tweezers | SPI | 0WSSS-XD | http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 |
| 50 ml tube | BD Falcon | 352070 | http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp |
| Available from multiple companies. | |||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 kit | http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx?R=131EN |
| The package contains both PDMS base and curing agent. Similar elastomers are available from multiple companies. | |||
| Microscope glass slides | Dutscher | 100001 | http://www.dutscher.com/frontoffice/search |
| Available from multiple companies. | |||
| DMEM high-glucose medium | Fisher Scientific | 41965-039 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?LBCID=12301479&keyWord=41965-039&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Bovine calf serum | Sigma-Aldrich | C8056-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en®ion=CA |
| 0,25% Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 25200-072 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS 1X | Fisher Scientific | 14200-067 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| PBS is at 10X and should be diluted to 1X using ddH2O | |||
| L-15 medium | Fisher Scientific | 21083-027 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=PROD |
| Medium for atmospheres without CO2 control | |||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=F1141-5MG&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Penicillin & Streptomycin | Fisher Scientific | 15140-122 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122&store=Scientific&nav=0&offSet=0&storeId=10652&langId=-1&fromSearchPage=1&searchType=CHEM |
| Petri dish P35 | Greiner | 627102 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/ |
| Petri dish P60 | Greiner | 628163 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/ |
| Petri dish P94 | Greiner | 633179 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/ |
| Paraformaldehyde 3 % | Sigma-Aldrich | P6148-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr®ion=FR |
| Harmful in-particular for the eyes, working in a fumehood is required; check the data sheet from the manufacturer for more information. | |||
| Triton 0.5 % | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=93443-100ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Phallodin-Green Fluorescent Alexa Fluor 488 | InVitrogen | A12379 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379?CID=search-a12379 |
| dissolve powder in 1.5 ml methanol | |||
| Alexa Fluor 647 | InVitrogen | A21245 | 1:200 dilution in PBS 1X |
| rabbit polyclonal anti-Giantin | Abcam | ab24586 | 1:500 dilution in PBS 1X |
| http://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html | |||
| rabbit anti-anillin | Courtesy of M. Glotzer, Published in Piekny, A. J. & Glotzer, M. Anillin is a scaffold protein that links RhoA, actin, and myosin during cytokinesis. Current biology 18, 30–6 (2008). | 1:500 dilution in PBS 1X | |
| Anti-phosphotyrosine | Transduction Lab | 610000 | http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 |
| Cy3 goat anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 111-166-047 | http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp |
| 1:1000 dilution in PBS 1X | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr®ion=FR |
| 1 mg/ml for 1 min | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=G2025&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410-500ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All&term=M8410-500ML&lang=en®ion=CA&focus=product&N=0+220003048+219853082+219853286&mode=match%20partialmax |
| HeLa cells | – | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| NIH3T3 cells | ATCC | – | Mammalian cells are available from many companies. See also Table 1 |
| Fission yeast | – | – | For details on strains, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| C. elegans worms | – | – | For details, contact the corresponding author. See also Table 1 |
| YES (Agar) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-732 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| YES (Media) + 5 Supplements included | MP Biomedicals | 4101-522 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522&s=Search |
| For preparation: follow the instructions as given on the box | |||
| EMM (Media) | MP Biomedicals | 4110-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012&s=Search |
| For preparation: follow instructions as given on the box | |||
| Filter sterilized EMM (Media) – Only for imaging | MP Biomedicals | 4110-012 | For preparation: follow instructions as given on the box. Filter sterilize the media using a 0.22 µm filter instead of autoclaving. This gives transparency to the media and reduces the autofluorescence. |
| Supplements (for EMM) | MP Biomedicals | 4104-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012&s=Search |
| (Add 225mg/l into the EMM media before autoclaving or filtering) | |||
| Stericup and Steritop Vaccum driven sterile filters | Millipore | – | http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare&tab1=2&tab2=1#tab2=1:tab1=2 |
References
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