مناعي للبروتينات الغشاء الخارجي بواسطة التدفق الخلوي من الميتوكوندريا المعزولة
Summary
الموصوفة هنا هي طريقة لكشف وقياس بروتينات الميتوكوندريا الغشاء الخارجي immunolabeling الميتوكوندريا المعزولة من أنسجة القوارض وتحليل التدفق الخلوي. هذا الأسلوب يمكن أن تمتد لتقييم الجوانب الفنية من مجموعات سكانية فرعية الميتوكوندريا.
Abstract
طرق لكشف ورصد مكونات الميتوكوندريا البروتين الغشاء الخارجي في الأنسجة الحيوانية ضرورية لدراسة علم وظائف الأعضاء الميتوكوندريا والفيزيولوجيا المرضية. يصف هذا البروتوكول تقنية حيث يتم immunolabeled الميتوكوندريا المعزولة من أنسجة القوارض وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي. يتم عزل الميتوكوندريا من القوارض النخاع الشوكي وتعرض لخطوة تخصيب السريعة وذلك لإزالة النخاعين، ملوثا خطيرا الكسور الميتوكوندريا أعدت من النسيج العصبي. ثم وصفت الميتوكوندريا المعزولة مع الأجسام المضادة الاختيار ومجموعة الضد الثانوية مترافق fluorescently. تحليل التدفق الخلوي يتحقق نقاء النسبي الاستعدادات الميتوكوندريا بواسطة تلطيخ مع صبغة محددة الميتوكوندريا، تليها الكشف النوعي والكمي للبروتين immunolabeled. هذه التقنية هي سريعة، وقابلة للقياس الإنتاجية العالية، مما يسمح لتحليل مئات الآلاف من الميتوكوندريا في العينة. فإنه ينطبق على تقييم الرواية صroteins على سطح الميتوكوندريا تحت الظروف الفسيولوجية العادية وكذلك البروتينات التي قد تصبح mislocalized لهذه العضية خلال علم الأمراض. الأهم من ذلك، يمكن أن يقترن هذا الأسلوب لمؤشر الأصباغ الفلورية أن يقدم تقريرا عن أنشطة بعض المجموعات السكانية الفرعية الميتوكوندريا وممكنا لالميتوكوندريا من الجهاز العصبي المركزي (الدماغ والحبل الشوكي)، وكذلك الكبد.
Introduction
الميتوكوندريا هي عضيات ديناميكية للغاية التي تخضع لجولات متعددة من الانشطار والانصهار، ويتم نقلها إلى مواقع من ارتفاع الطلب على الطاقة والاستجابة السريعة لمحفزات الفسيولوجية 1. لأنه يتزايد الاعتراف بأن الميتوكوندريا داخل الأنسجة المختلفة، مقصورات الخلوية حتى مختلفة، لديها ملامح وظيفية متميزة، وهناك حاجة إلى أساليب جديدة لتحديد هذه الميتوكوندريا مجموعات فرعية متميزة.
يوفر المجهري وسيلة يمكن من خلالها تصور الميتوكوندريا الفردية ووجود بروتين في أو في الميتوكوندريا يمكن تحديده من خلال المناعي 2. ومع ذلك، والتحليل الكمي من هذا الأسلوب هو عمالة كثيفة وأكثر ملاءمة للتجارب باستخدام خطوط الخلايا خلد أو الأولية. دراسة الميتوكوندريا الفردية المستمدة من الأنسجة بشكل ملحوظ أكثر صعوبة ومعظم الطرق لا تسمح لسهولة تحديد مجموعات فرعية الميتوكوندريا بالتزامن مع evaluأوجه من وظيفة الميتوكوندريا 3.
من أجل معالجة هذه العقبة، طريقة جديدة لimmunolabel الميتوكوندريا المعزولة من أنسجة القوارض وتحليلها لاحقا من قبل التدفق الخلوي تم تطويره. وهذا يسمح للكشف السريع والكمي للبروتينات مترجمة إلى الغشاء الخارجي الميتوكوندريا، مما مقارنة التحليل المجهري، هو أقل بكثير كثيفة العمالة ويسمح تحليل الآلاف من الميتوكوندريا في عينة واحدة. ويمكن تطبيق هذا الاختبار لمراقبة مصير وقدر نسبي من الميتوكوندريا بروتينات الغشاء الخارجي التي يعتقد أن تكون موجودة جوهري في الميتوكوندريا، وتعيين من البروتينات على سطح الميتوكوندريا، أو الكشف عن البروتينات mislocalized إلى الميتوكوندريا في الحالات المرضية. وعلاوة على ذلك، فإن إدماج التقليدية الأصباغ الفلورية مؤشر يسمح بتقييم وقت واحد من جوانب معينة من وظيفة الميتوكوندريا في الميتوكوندريا متميزةمجموعات سكانية فرعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ومن الواضح بشكل متزايد أن الميتوكوندريا هي اللاعبين الرئيسيين في كل من علم وظائف الأعضاء والمرض العادي. بينما immunoblotting يمكن تحديد البروتينات التي توجد داخل الميتوكوندريا أو على سطح الميتوكوندريا في حالة معينة، وهذه الطريقة تقارير في المتوسط من مجموع السكان. هذه ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر لوري وسارة Destroismaisons بيرار للدعم التقني المتميز وDr.Alexandre برات للوصول إلى تدفق عداد الكريات. ونود أيضا أن نعترف الدكتور تيموثي ميلر لمساهمته بشأن إزالة المايلين من التحضيرات. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث (CIHR) الشراكة الصحة العضلية بحوث، المؤسسة الكندية للإبداع، جمعية ALS كندا، ومؤسسة فريك للبحوث ALS، مؤسسة CHUM وFONDS دي لا سانتيه بحوث في كيبيك (CVV). كلا CVV وNA هم علماء البحوث في FONDS للبحوث أون سانتيه كيبيك وCIHR المحققون جديد. ويدعم SP من قبل تيم نويل Studentship من جمعية ALS كندا.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rats | Charles River | Strain code 400 | Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used. |
| Dounce homogenizer | Kontes Glass Co. | 885450-0022 | Duall 22 |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend Micro 17 R | |
| Ulara-Clear Ultracentrifuge tubes | Beckman Coultier | 344057 | Transparent, thin walled |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall WX UltraSeries | |
| AH-650 rotor and buckets | Thermo Scientific | ||
| Opti-prep | Axis-Shield | 1114542 | Iodixanol, density gradient medium |
| Fatty acid free Bovine Serum Albumin | Sigma | A8806 | Must be fatty acid free for mitochondria |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S9637 | |
| Rabbit anti-Mitofusin2 antibody | Sigma | M6319 | |
| Rabbit IgG | Jackson Immuno Research | 011-000-003 | |
| Anti-Rabbit IgG PE | eBioscience | 12-4739-81 | |
| Micro titer tube | Bio-Rad | 223-9391 | For sample acquisition by flow cytometry |
| MitoTrackerGreen (MTG) | Invitrogen | M7514 | 100 nM: Ex490 nm/Em516 nm |
| TMRM | Invitrogen | T668 | 100 nM: Ex548 nm/Em574 nm |
| CCCP | Sigma | C2759 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | 5 µM: Ex540 nm/Em600 nm |
| Antimycin A | Sigma | A8874 | |
| LSR II flow cytometer | BD | ||
| BS FACSDiva Software | BD | ||
| FlowJo | TreeStar Inc. | Software used for analysis | |
| BCA protein assay kit | Pierce/Thermo Scientific | 23225 | Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS |
References
- Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. Mitochondrial dynamics in neurodegeneration. Trends Cell Biol. 23, 64-71 (2013).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. J Cell Biol. 183, 795-803 (2008).
- Zorov, D. B., Kobrinsky, E., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Examining intracellular organelle function using fluorescent probes: from animalcules to quantum dots. Circ Res. 95, 239-252 (2004).
- Vande Velde, C., Miller, T., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4022-4027 (2008).
- Loew, L. M., Tuft, R. A., Carrington, W., Fay, F. S. Imaging in five dimensions: time-dependent membrane potentials in individual mitochondria. Biophys J. 65, 2396-2407 (1993).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50, 98-115 (2011).
- Xu, X., Arriaga, E. A. Qualitative determination of superoxide release at both sides of the mitochondrial inner membrane by capillary electrophoretic analysis of the oxidation products of triphenylphosphonium hydroethidine. Free Radic Biol Med. 46, 905-913 (2009).
- Otera, H., Ishihara, N., Mihara, K. New insights into the function and regulation of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta. 1833, 1256-1268 (2013).
- de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
- Wikstrom, J. D., Twig, G., Shirihai, O. S. What can mitochondrial heterogeneity tell us about mitochondrial dynamics and autophagy. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1914-1927 (2009).
- Pickles, S., Destroismaisons, L., Peyrard, S. L., Cadot, S., Rouleau, G. A., Brown, R. H., Julien, J. P., Arbour, N., Vande Velde, C. Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1. Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).
- Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis. Dev Cell. 1, 515-525 (2001).
- West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472, 476-480 (2011).
- Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalhães, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant. J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).
- Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).
- Tantama, M., Martinez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4, 2550 (2013).
