הפרוטוקול שמטרתו לייעל את הבנייה ואיכות של microarrays רקמות למחקר סמן ביולוגי. הוא כולל היבטים של תכנון ועיצוב, פתולוגיה הדיגיטלית, ביאור שקופיות וירטואלי, וarraying רקמות האוטומטית.
מחקר סמן ביולוגי מסתמך על microarrays רקמות (TMA). TMAs מיוצר על ידי העברה חוזרת ונשנית של ליבות רקמה קטנות מבלוק 'תורם' לגוש 'נמען' ולאחר מכן משמש למגוון רחב של יישומי סמן ביולוגי. הבנייה של TMAs הקונבנציונלי היא עבודה אינטנסיבית, לא מדויק, וגוזל זמן. הנה, פרוטוקול באמצעות מערכי רקמות הדור הבא (ngTMA) מתואר. ngTMA מתבסס על תכנון TMA ועיצוב, פתולוגיה הדיגיטלית, וmicroarraying רקמות אוטומטית. הפרוטוקול בא לידי ביטוי באמצעות דוגמא של 134 חולי סרטן מעי גס גרורתי. היבטים היסטולוגית, סטטיסטיים ולוגיסטיים נחשבים, כגון סוג הרקמה, אזורים היסטולוגית ספציפיים, וסוגי תאים לצורך ההכללה בTMA, מספר כתמי רקמה, גודל מדגם, ניתוח סטטיסטי, ומספר עותקי TMA. שקופיות היסטולוגית לכל מטופל נסרקות והועלו פלטפורמה דיגיטלית מבוסס אינטרנט. שם, הם נתפסים ואןotated (מסומן) באמצעות כלי קוטר .6-2.0 מ"מ, מספר פעמים תוך שימוש בצבעים שונים כדי להבחין אזורי רקמות. בלוקים תורם ו12 לוקים 'נמען' נטענים לתוך המכשיר. שקופיות דיגיטליות אחזור והתאמה לתמונות בלוק תורם. arraying חוזר ונשנה של אזורים מבואר באופן אוטומטי מתבצע וכתוצאה מכך ngTMA. בדוגמא זו, שש ngTMAs מתוכננים מכיל שישה סוגים שונים של רקמות / אזורים היסטולוגית. שני עותקים של ngTMAs הם רצויים. שלוש עד ארבע שקופיות לכל מטופל נסרקים; 3 ריצות סריקה נחוצות ובוצע בין לילה. כל השקופיות מבוארת; צבעים שונים משמשים כדי לייצג את הרקמות / אזורים השונים, כלומר מרכז גידול, מול פלישה, גידול / סטרומה, גרורות בלוטה לימפה, גרורות בכבד, ורקמות נורמליות. 17 הסברים / מקרה נעשים; זמן להסברים הוא 2-3 דק '/ מקרה. 12 ngTMAs מיוצר מכיל 4,556 נקודות. Arraying זמן הוא 15-20 שעה. בשל הדיוק, הגמישות והמהירות שלו, ngTMA היא רב עוצמהכלי לשיפור איכות TMAs נוסף המשמש במחקר קליני וtranslational.
במהלך שני העשורים האחרונים, microarrays רקמות (TMAs) יש לו השפעה יוצאת דופן על מחקרי חקירת סמן ביולוגי. TMAs הוא בעצם "ארכיון" המיוצר על ידי ההעברה החוזרת ונשנית של ליבות רקמה קטנות, בדרך כלל החל בגודל .6-2.0 מ"מ קוטר רקמה, מקוביות "תורם" פרפין המוטבע לתוך בלוק אחד TMA 'נמען' (איור 1) 1. שימוש בגודל ליבה קטן, כ 500 כתמי רקמות שונים מחולים שונים מעט או רבים יכולים להיות ערוך לאחד TMA 2.
השימוש בTMAs ללימודי סמן ביולוגי פרוגנוסטיים או חזוי יש יתרונות רבים. קחו למשל את הדוגמא שבה ביטוי של סמנים ביולוגיים חלבון על ידי אימונוהיסטוכימיה הוא להיות מוערך על 450 חולים. במקום ביצוע 450 כתמי immunohistochemical על 450 שקופיות מטופל מחולק מאותו מספר בלוקים, ניתן ערוכות ליבות קטנות מכל מדגם על T בודדבלוק MA. גם אם ליבות מרובות לקוחים מכל מטופל באופן אישי, מספר מינימאלי של בלוקים מיוצר. יש לכך ההשפעה הניכרת של אופן דרסטי פוחת עלויות ומשאבים אחרים, כמו גם הפחתת הרס רקמות. מחקרים בנוסף זה מאפשר מופעל כראוי באמצעות מספר רב של רקמות כדי להיות מוערכים באותם תנאי הניסוי.
יש לי TMAs יישומים רבים ושונים. לדוגמא, הם יכולים לשמש כדי לחקור מורפולוגיה, ביטוי חלבון, ביטוי RNA וסטיות DNA הבא צביעה עם צבעים שונים, או לאחר אימונוהיסטוכימיה או chromogenic ואפילו הקרינה הכלאה באתר 3-7. גם מחקרים שנעשו לאחרונה שימוש TMAs לבדוק וריאציה הפנים ומעבדתיות בפרוטוקולים מכתים, להקים סגוליות או רגישות של נוגדנים למוטציות גנטיות ספציפיות, ולקבוע את שחזור interobserver של ביטוי חלבון בשיתופי פעולה בינלאומי <sup> 8-11.
הבנייה של TMAs המסורתי באמצעות רקמות המופק ממטופל היא הליך צעד רב ארוך (איור 2). זה מתחיל בחיפוש אחר מקרים מתאימים אפשריים ובחירה של שקופיות אבחון מהארכיונים במכון לפתולוגיה, או מוסד אחר, מהמקום שבו הם תוחזר. פתולוג מעריך כל שקופית לכל מקרה ובוחר את השקופית המייצגת ביותר למטרות המחקר. בשלב הבא, את האזור של עניין מסומן באמצעות עט ישירות מתחת למיקרוסקופ. זה הוא לעתים קרובות מאתגר ולא מדויק ותוצאות רק ב" הערכה "של איפה יש לנקוט אגרופים רקמה מ. בשלב בא, בלוקים פרפין המתאימים לשקופיות מסומנות אלה שנאספו מהארכיון. השוואה מהירה בין הבלוק והשקופיות נעשתה. באמצעות arrayer רקמה חצי אוטומטי או תוצרת בית, בלוק תורם אגרוף באזור המשוער של ריבית והועבר לגוש TMA נמען. בנייה של TMAs באמצעות טכניקת arraying זו היא עבודה אינטנסיבית, זמן רב, לא מדויקת, ולא גמישה. הכנת TMA של 475 נקודות ב 3 עותקים היא מוערכת לקחת על 84 שעות של עבודה.
גישה חדשה לבנייה של TMAs הוצגה לאחרונה על ידי המכון לפתולוגיה, האוניברסיטה ברן שמסתמכת על שלושה מרכיבים: תכנון ועיצוב (או ייעוץ), פתולוגיה הדיגיטלית בשילוב עם מומחיות בהיסטולוגיה וTMA האוטומטי arraying 12. יחד, מושג זה נקרא רקמות הדור הבא Microarray (ngTMA). להלן, פרוטוקול לngTMA מתואר מבוסס על דוגמא של 134 חולים עם סרטן מעי גס גרורתי. כאן, גידולים ראשוניים, כמו גם גרורות בלוטה לימפה וגרורות בכבד יש ערוכים לngTMAs לניתוח סמן ביולוגי שלאחר מכן. בנוסף, ליבות רקמה קטנות מכל מטופל הן רצויים להפקת חומצת גרעין עתיד.
במאמר זה, פרוטוקול לngTMA מתואר. ngTMA הוא מושג חדש שהוקם לmicroarraying הרקמה מעורב בתכנון ועיצוב, פתולוגיה הדיגיטלית וביאור שקופיות, כמו גם אוטומטי microarraying הרקמה 12.
בהשוואה לmicroarraying רקמה הקונבנציונלית, ngTMA מציע יתרונות רבים. בשלב ראשון, שלב תכנון והעיצוב הוא קריטי. הדגש הוא על מענה לשאלת מחקר ממוקד. זה צריך לקחת בחשבון את הנושאים היסטולוגית (למשל, שאזורים וכמה כתמים אני רוצה לכלול?), תכנון הסטטיסטי (למשל, גודל מדגם? כיצד לנתח הדגימות שלי מאוחר יותר?) ושיקולים לוגיסטיים (למשל, איך סמנים ביולוגיים רבים ולכן כמה עותקי ngTMA רבים?). NgTMA ספציפי הוא עשה עבור הצרכים ספציפיים, בין אם זה להקרנת סמן ביולוגי ותפוקה גבוהה או מיועד ללמוד היבטים היסטולוגית ספציפיים על רק cas נבחר גם כמהes.
אחת, אם לא, חסרון החשוב ביותר של microarraying רקמה הקונבנציונלית הוא הדיוק הנמוך שבה סימונים על השקופיות היסטולוגית נעשים. המחקר של ספציפיים מבנים, תאים או אזורים היסטולוגית נעשה כמעט בלתי אפשרי. ngTMA מאפשר רמת דיוק גבוהה, כי הסברים מונחים ישירות על השקופיות הדיגיטליות. זה מאפשר לחוקר לבחור דווקא האזורים לחטוף מכות, כולל תאים ספציפיים. בדוגמא זו, אזורים שונים בתוך אותו גוש הרקמה נחתכים החוצה לarraying, כגון מרכז הגידול, מול הפלישה ותחומים של אינטראקציה הגידול / stroma המודגש על ידי הנוכחות של צבירי תאים סרטניים קטנים או אפילו תאים בודדים. דיוק זו יכול להיות מושגת רק באמצעות ngTMA. שלישית, משום ששקופיות נסרקות על גבי פלטפורמה דיגיטלית מבוסס אינטרנט, החלק את הצפייה והוספת הערות יכולות להתבצע דרך המחשב ולא עם מיקרוסקופ. תוכנת arraying הרקמה מספקת ידידותי למשתמשממשק עם רמה גבוהה של גמישות, פריסות שונות ולכן ועיצוב ngTMA יכול להיות מושגת. מאז בניית TMA מתבצעת באופן אוטומטי על ידי קידוח, יש צורך קטן לידות על תמרון ואת משך זמן לבנייה מצטמצמת משמעותית. הזמן לבניית TMA בדוגמא כאן הוא בין 24 שעות. שימוש בגישה TMA קונבנציונלית והערכת 15 אגרופים לשעה, הפרויקט הזה היה לוקח כ 304 שעה.
יכול להיות מיושם ngTMA ללמוד ביטוי חלבון, mRNA או DNA, כמו גם שילובים של אלה. איור 9 ממחיש כמה של יישומים אלה לסמנים ביולוגיים פוטנציאליים. אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית יכולה להיות מיושמת על מנת לקבוע את מדד ההתפשטות של סרטן באמצעות קי 67. גישה משולבת לחקור ביטוי חלבון והגברת DNA לגנים כגון HER2 ניתן להשתמש. יכולות להיות שנאספו רקמות יחד על ngTMA אחד כדי להפחית את העלויות, שימוש ברקמות ומשאבים אחריםים. בנוסף, mRNA chromogenic הכלאה באתר לHER2 וגנים אחרים ניתן לבצע כדי לזהות תעתיקי mRNA בודדים במספר רב של מקרים תוך שימוש במספר מינימאלי של שקופיות רקמות. אימונוהיסטוכימיה של סמנים חיסוניים כגון CD8 ניתן דמיין בהקשר של microenvironment הגידול. גם אימונוהיסטוכימיה זוגית יכולה לשמש כדי להדגיש אזורים מסוימים של עניין, כגון יחסי גומלין בין תאי מערכת חיסון (שכותרת באדום) ותאים סרטניים (שכותרתו בחום) בחזית הפלישה של סרטן. כגון אזור של עניין לא ניתן היה נתפס באמצעות microarraying רקמה קונבנציונלית.
עם זאת, פרוטוקול זה מכיל כמה מגבלות. האתגר החשוב ביותר הוא החפיפה בין בלוק תורם ושקופיות דיגיטליות. מספר גורמים יכולים להשפיע על שלב זה. ראשית, הסעיף האחרון מהבלוק צריך לשמש לסריקת שקופיות. במקרים רבים, H & E היא לא החלק האחרון של בלוק תורם, rather זה immunohistochemical או אחר כתם. במקרה זה, גם שקופיות מוכתמות יכולות לשמש עוד ככתם האחרון נסרק ומבואר או H & E חדשים צריך להיעשות. צריכה גם להיזהר בעת סעיפי רקמות נעשים כרקמות עשויות להתרחב באמבט המים שמוביל להתאמה מאתגרת של שקופיות ובלוק. שנית, ברגע פרויקטים מוגבלים ללוקי TMA נמען 12 מעובד בכל פעם אחת. פרויקטים גדולים העולים על 12 TMAs יש להקצות לשם פרויקט שני. שלישית, בלוקים התורם חייבים להיעשות באמצעות תבניות סטנדרטי וקלטות כמכשיר לא יכול להתאים את עצמו לגדלים שונים. לבסוף, בלוקים תורם חייבים לעלות על הגובה המינימלי (4 מ"מ) כדי להשיג קידוח אופטימלי. בחלק מהמקרים, זה דורש reembedding של רקמות.
מאות פרסומים בשנים האחרונות להדגיש את TMA ככלי רב ערך למחקר סמן ביולוגי. TMAs היה בשימוש ללמוד ריאות 13, מעי גס 7, BREAST 14, ערמונית 15, לבלב 16, שלפוחית השתן 17, ו18 סרטן הקיבה, עד כמה שם. מספר גדל והולך של סופרים שילבו השימוש בTMAs עם ניתוח תמונה וצעדים משמעותיים שנעשים בכיוון זה 19-21. עם זאת, לצד קומץ קבוצות מחקר שפרסמו את רעיונות TMA חדשניים 22-24, מעט תשומת לב ניתנה כדי לייעל את טכניקת TMA עצמו. microarrayers רקמה אוטומטית, כגון ATA-27 ידי Estigen / יצ'ר לעשות מספק עיצוב פריסה וחבטות רקמה רצויות ואוטומטיות. זה מייצג זאת היבט 1 בלבד של מושג ngTMA.
ngTMA הוא שיפור משמעותי על פני שיטות microarraying הרקמה קונבנציונליות. היא משלבת מומחיות בהיסטולוגיה ועיצוב TMA עם הגמישות של הפתולוגיה דיגיטלית והדיוק של הסברים דיגיטליים עם המהירות ואמינות של בניית TMA אוטומטית. השילוב של ngTMוניתוח תמונה להערכת סמנים ביולוגיים חלבון ומולקולרי יהיו כלי רב עוצמה כדי לשפר את איכות המחקר קליני וtranslational בעתיד עוד יותר.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות לצוות הטכני של Translational יחידת המחקר; מרי Economou, José Galván, קרוליין האמר, דומיניק מילר, ליליאן Schöni והקבוצות מידענות במכון לפתולוגיה, האוניברסיטה ברן.
Pannoramic 250 Flash II | 3DHistech | Slide scanner | |
TMA Grandmaster | 3DHistech | Tissue Microarrayer | |
Pannoramic Viewer | 3DHistech | free | Slide viewing software |
Case Center | 3DHistech | Digital slide platform |