El protocolo tiene como objetivo la optimización de la construcción y la calidad de los microarrays de tejidos para la investigación de biomarcadores. Incluye aspectos de la planificación y el diseño, la patología digital, la anotación de la diapositiva virtual, y arraying tejido automatizado.
La investigación de biomarcadores se basa en microarrays de tejidos (TMA). TMA se producen por transferencia repetida de pequeños núcleos de tejido de un bloque "donante" en un bloque de "receptor" y luego se usa para una variedad de aplicaciones de biomarcadores. La construcción de TMA convencional es de mano de obra, impreciso y requiere mucho tiempo. Aquí, un protocolo utilizando microarrays de tejidos de última generación (ngTMA) se resume. ngTMA se basa en la planificación y diseño de TMA, la patología digital, y microarraying tejido automatizado. El protocolo se ilustra utilizando un ejemplo de 134 pacientes con cáncer colorrectal metastásico. Se consideran aspectos histológicos, estadísticos y logísticos, como el tipo de tejido, las regiones histológicas específicas, y tipos de células para su inclusión en el TMA, el número de manchas de tejidos, tamaño de la muestra, el análisis estadístico, y el número de copias de TMA. El estudio histológico de cada paciente son escaneados y subidos a una plataforma digital basada en la web. Allí, ellos son vistos y annotated (marcado) utilizando una herramienta de diámetro 0,6-2,0 mm, varias veces utilizando diferentes colores para distinguir las áreas de tejido. Bloques donantes y 12 bloques 'receptores' se cargan en el instrumento. Diapositivas digitales se recuperan y adaptan a las imágenes de bloque donante. Arraying repetido de regiones anotadas es automática, consiguiéndose en un ngTMA. En este ejemplo, se han previsto seis ngTMAs que contiene seis diferentes tipos de tejidos / zonas histológicas. Dos copias de los ngTMAs se desean. De tres a cuatro diapositivas para cada paciente son escaneados; 3 ejecuta el análisis son necesarios y realizado durante la noche. Todas las diapositivas son anotados; se utilizan diferentes colores para representar los diferentes tejidos / zonas, a saber, el centro del tumor, frente a la invasión, tumor / estroma, metástasis ganglionares, metástasis hepáticas, y el tejido normal. 17 anotaciones / caso se hacen; tiempo para la anotación es de 2-3 min / caja. 12 ngTMAs se producen contiene 4.556 puntos. Tiempo Arraying es de 15-20 horas. Debido a su precisión, flexibilidad y velocidad, ngTMA es un potenteherramienta para mejorar aún más la calidad de las TMA utiliza en la investigación clínica y traslacional.
En las últimas dos décadas, microarrays de tejidos (TMA) han tenido un impacto notable en los estudios de investigación de biomarcadores. TMA son esencialmente de tejido "archivos" producidas por la transferencia repetida de pequeñas cuñas de tejido, por lo general varían en tamaño desde 0,6 hasta 2,0 mm de diámetro, desde embebidos en parafina bloques "donantes" en un solo bloque TMA 'receptor' (Figura 1) 1. Con un pequeño tamaño del núcleo, aproximadamente 500 diferentes puntos de tejido de pocos o muchos pacientes diferentes pueden ser dispuestos en una TMA 2.
El uso de la TMA para estudios de biomarcadores pronósticos o predictivos tiene muchas ventajas. Considere el ejemplo donde la expresión de un biomarcador de proteína por inmunohistoquímica se va a evaluar en 450 pacientes. En lugar de realizar 450 tinciones inmunohistoquímicas en 450 diapositivas paciente seccionadas desde el mismo número de bloques, pequeños núcleos de cada muestra pueden ser dispuestas en una sola TBloque MA. Aunque varios núcleos se toman de cada paciente, se produjo un número mínimo de bloques. Esto tiene el efecto considerable de disminuir drásticamente los costos y otros recursos, así como la reducción de pérdida de tejido. Además esto permite estudios powered apropiadamente utilizando un gran número de tejidos a ser evaluadas bajo las mismas condiciones experimentales.
TMA tiene muchas aplicaciones diferentes. Por ejemplo, pueden ser utilizados para estudiar la morfología, expresión de proteínas, expresión de ARN y las aberraciones de ADN después de la tinción con colorantes diferentes, o después de inmunohistoquímica o cromogénico e incluso hibridación in situ fluorescente 3-7. Estudios recientes también han utilizado las TMA para probar la variación intra e interlaboratorios en los protocolos de tinción, establecer la especificidad o sensibilidad de los anticuerpos para las mutaciones de genes específicos, y para determinar la reproducibilidad entre observadores de la expresión de proteínas en las colaboraciones internacionales <sup> 8-11.
La construcción del tradicional TMA utilizando tejidos derivados del paciente es un largo proceso de múltiples fases (Figura 2). Se inicia con la búsqueda de posibles casos apropiados y selección de diapositivas de diagnóstico de los archivos en un instituto de patología, u otro instituto, desde donde se recuperan. El patólogo evalúa cada diapositiva por caso y selecciona la diapositiva más representativo para los propósitos del estudio. A continuación, la región de interés se marca con un lápiz directamente bajo el microscopio. Esto es a menudo difícil e imprecisa y da como resultado sólo en una "estimación" de dónde golpes de tejidos deben tomarse de. A continuación, los bloques de parafina correspondientes a estas diapositivas marcadas se recuperan del archivo. Se hace una comparación rápida entre el bloque y el tobogán. El uso de un arrayer semi-automatizado o tejido hecho en casa, el bloque donante se troquela en la región estimada de interés y se transfirió a un bloque de TMA destinatario. Construcción de TMA utilizando esta técnica de agrupación es un trabajo intensivo, consume tiempo, impreciso y poco flexible. Preparación de una TMA de 475 puntos en 3 copias se estima para tomar cerca de 84 horas de trabajo.
Un nuevo enfoque para la construcción de las TMA fue presentado recientemente por el Instituto de Patología de la Universidad de Berna que se basa en tres componentes: la planificación y el diseño (o asesoría), la patología digital combinada con la experiencia en la histología y automatizado TMA arraying 12. En conjunto, este concepto se llama Tissue próxima generación de microarrays (ngTMA). A continuación, un protocolo para ngTMA se describe sobre la base de un ejemplo de 134 pacientes con cáncer colorrectal metastásico. Aquí, los tumores primarios, así como metástasis en los ganglios linfáticos y las metástasis hepáticas son que se vista en ngTMAs para el análisis de biomarcadores posterior. Además, los pequeños núcleos de tejido de cada paciente se desean para el futuro de la extracción de ácidos nucleicos.
En este trabajo, un protocolo para ngTMA se perfila. ngTMA es un concepto de reciente creación para microarraying tejido que comprende la planificación y el diseño, la patología digital y anotación de diapositivas, así como automatizado microarraying tejido 12.
En comparación con microarraying tejido convencional, ngTMA ofrece muchas ventajas. En una primera fase, la fase de planificación y diseño es fundamental. La atención se centra en responder a una pregunta de investigación específica. Esto debe tomar en consideración las cuestiones histológicas (por ejemplo, que las regiones y el número de puntos es lo que quiero para incluir?), La planificación estadística (por ejemplo, tamaño de la muestra? ¿Cómo analizo mis muestras más tarde?) Y las consideraciones logísticas (por ejemplo, cómo muchos biomarcadores y, por tanto, el número de copias ngTMA?). A ngTMA específica se da con necesidades específicas, ya sea para la detección de biomarcadores y de alto rendimiento o la intención de estudiar los aspectos histológicos específicos en sólo unos pocos cas bien seleccionadaes.
Uno, si no el más importante desventaja de microarraying tejido convencional es la baja precisión con la que se hacen marcas en los cortes histológicos. El estudio de las estructuras histológicas, células o regiones específicas se hace casi imposible. ngTMA permite una alta exactitud porque las anotaciones se colocan directamente en las diapositivas digitales. Esto permite que el investigador para seleccionar precisamente las regiones a punzonar, incluyendo las células específicas. En este ejemplo, varias áreas dentro del mismo bloque de tejido se troquelan para poner en orden, tales como el centro del tumor, el frente de invasión y áreas de interacción de tumor / estroma de relieve por la presencia de grupos de células tumorales pequeñas o incluso células individuales. Esta precisión sólo puede lograrse utilizando ngTMA. En tercer lugar, porque las diapositivas se escanean en una plataforma digital basada en la web, deslice la visualización y anotación puede hacerse a través de la computadora en lugar de con el microscopio. El software arraying tejido proporciona un fácil de usarinterfaz con un alto grado de flexibilidad, por lo tanto, diferentes diseños y diseño ngTMA se puede lograr. Desde la construcción TMA se realiza automáticamente por la perforación, hay poca necesidad de se reduce significativamente con manos de maniobra y la cantidad de tiempo para la construcción. El tiempo para la construcción TMA en este ejemplo aquí es entre 24 hr. El uso de un enfoque convencional TMA y la estimación de 15 golpes por hora, este proyecto tomaría aproximadamente 304 horas.
ngTMA se puede aplicar para estudiar la expresión de proteína, ARNm o ADN, así como combinaciones de éstos. Figura 9 ilustra varias de estas aplicaciones a biomarcadores potenciales. Inmunohistoquímica estándar se puede aplicar para determinar el índice de proliferación de cánceres utilizando Ki-67. Un enfoque combinado para investigar la expresión de proteínas y la amplificación de ADN para los genes tales como HER2 puede ser utilizado. Los tejidos pueden ser reunidas en un solo ngTMA para reducir los costos, el uso de tejidos y otros recursoss. Además, el ARNm cromogénico hibridación in situ para HER2 y otros genes se puede realizar para identificar las transcripciones de ARNm individuales en un gran número de casos utilizando un número mínimo de diapositivas de tejidos. La inmunohistoquímica de los marcadores inmunes tales como CD8 puede ser visualizado en el contexto del microambiente del tumor. Doble inmunohistoquímica también se puede utilizar para resaltar regiones particulares de interés tales como las interacciones entre las células inmunes (marcados en rojo) y células tumorales (marcados en marrón) en el frente de invasión de los cánceres. Tal región de interés no podría haber sido capturado utilizando microarraying tejido convencional.
No obstante, este protocolo contiene algunas limitaciones. El reto más importante es el solapamiento entre el bloque de los donantes y de diapositivas digitales. Hay varios factores que pueden influir en este paso. En primer lugar, la última sección del bloque se debe utilizar para el escaneado de diapositivas. En muchos casos, la H & E no es la última sección del bloque donante, Rather es una tinción inmunohistoquímica u otro. En este caso, también un portaobjetos teñido puede ser utilizado siempre y cuando la última mancha se escanea y anotado o debe hacerse una nueva H & E. También se debe tener cuidado cuando se hacen cortes de tejido como los tejidos pueden expandirse en el baño de agua que conduce a juego desafiante de diapositivas y el bloque. En segundo lugar, en este momento los proyectos se limitan a 12 receptores TMA bloques procesados en una sola vez. Los proyectos más grandes de más de 12 TMA deben asignarse a un segundo nombre del proyecto. En tercer lugar, los bloques donantes deben hacerse usando moldes estándar y casetes como el instrumento no puede ajustarse a diferentes tamaños. Por último, los bloques donantes deben superar la altura mínima (4 mm) para lograr la perforación óptima. En algunos casos, esto requiere reembedding de los tejidos.
Cientos de publicaciones en los últimos años ponen de manifiesto la TMA como una valiosa herramienta para la investigación de biomarcadores. TMA se han utilizado para estudiar pulmonar 13, colorrectal 7, breast 14, 15 de próstata, páncreas 16, la vejiga 17, y 18 cánceres gástricos, para nombrar unos pocos. Un creciente número de autores han combinado el uso de TMA con el análisis de imágenes y pasos importantes se están haciendo en esta dirección 19-21. Sin embargo, junto a un puñado de grupos de investigación que han publicado las ideas innovadoras TMA 22-24, se ha prestado poca atención a la optimización de la técnica de TMA en sí. Microarrayers tejido automatizados, como el ATA-27 por Estigen / Beecher proporcionan esquema de trazado y conveniente y automatizado de perforación del tejido. Sin embargo, esto representa sólo 1 aspecto del concepto ngTMA.
ngTMA es una mejora sustancial respecto a las técnicas convencionales microarraying tejido. Incorpora experiencia en la histología y el diseño TMA con la flexibilidad de la patología digital y la precisión de las anotaciones digitales con la velocidad y la fiabilidad de la construcción automatizada de TMA. La combinación de ngTMA y análisis de imágenes para la evaluación de proteínas y biomarcadores moleculares será una herramienta poderosa para mejorar aún más la calidad de la investigación clínica y traslacional en el futuro.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer al personal técnico de la Unidad de Investigación Traslacional; María Economou, José Galván, Caroline Hammer, Dominique Müller, Liliane Schöni y el Equipo de Informática en el Instituto de Patología de la Universidad de Berna.
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