Souris foie fœtal Système de culture à disséquer les fonctions du gène cible dans les stades précoces et tardifs de l'aérogare de l'érythropoïèse
Summary
Nous présentons un système in vitro de culture de fœtus de souris des érythroblastes de foie qui dissèque les stades précoces et tardifs de l'érythropoïèse terminale. Ce système facilite l'analyse fonctionnelle des gènes spécifiques à différents stades de développement.
Abstract
Érythropoïèse implique un processus dynamique qui commence avec des unités engagées en rafale érythroïde formant (BFU-Es) puis en divisant rapidement érythroïde unités formant colonie (UFC-Es). Après CFU-E, les cellules sont morphologiquement reconnaissable et généralement appelée érythroblastes terminaux. L'un des défis pour l'étude de l'érythropoïèse terminale est le manque d'approches expérimentales pour disséquer les fonctions des gènes d'une manière chronologique. Dans ce protocole, nous décrivons une stratégie unique pour déterminer la fonction des gènes dans les stades précoces et tardifs de l'érythropoïèse terminale. Dans ce système, la souris fœtale Ter119 du foie (marqueur des cellules érythroïdes matures) des érythroblastes négatifs ont été purifiés et transduites avec l'expression exogène d'ADNc ou de petits ARN en épingle à cheveux (shRNA) pour les gènes d'intérêt. Les cellules ont ensuite été cultivées dans des facteurs de croissance de milieu contenant d'autres de l'érythropoïétine (Epo) pour maintenir leur stade de progéniteurs pendant 12 heures tout en laissant les ADNc exogène ou shRNAà exprimer. Les cellules ont été modifiées pour Epo milieu après 12 heures pour induire la différenciation et la prolifération cellulaire, tandis que les matériaux génétiques exogènes ont déjà été exprimés. Ce protocole facilite l'analyse des fonctions des gènes dans le stade précoce de l'érythropoïèse terminale. Pour étudier la fin de l'érythropoïèse terminale de stade, les cellules ont été immédiatement mises en culture dans un milieu Epo après transduction. De cette manière, les cellules ont été déjà différenciées à la fin du stade de l'érythropoïèse terminale lorsque les matériaux génétiques transduites ont été exprimés. Nous recommandons une application générale de cette stratégie qui aiderait à comprendre les fonctions des gènes détaillées à différents stades de l'érythropoïèse terminale.
Introduction
L'érythropoïèse est le processus de différenciation de cellules souches hématopoïétiques multipotentes à maturité érythrocytes. Ce processus par étapes comprend la formation d'unités engagées en rafale érythroïde formant (BFU-E), les unités formant des colonies érythroïdes à division rapide (CFU-Es), et morphologiquement reconnaissables érythroblastes 1,2. Érythropoïèse terminale à partir de cellules souches CFU-E implique séquentielle érythropoïétine-dépendantes et indépendantes étapes 2,3. Dans le stade précoce de l'érythropoïèse terminale, l'érythropoïétine (EPO) se lie à son récepteur sur la surface cellulaire et induit une série de voies de signalisation en aval qui empêchent l'apoptose cellulaire et favorisent la division cellulaire rapide et l'expression du gène 1,4. À la fin du stade de l'érythropoïèse terminale, érythroblastes subissent sortie de la cellule terminale du cycle, de la chromatine et de noyaux de condensation, et l'extrusion des noyaux fortement condensés 5.
Notre compréhension de la borneérythropoïèse s'est grandement améliorée au cours des dernières décennies, ce qui est dû en grande partie à l'utilisation réussie de plusieurs in vitro et dans des modèles murins in vivo 6-9. Parmi ces modèles, la culture in vitro de souris fœtale érythroblastes de foie fournit de nombreux avantages, y compris la facilité de purification des cellules, la prolifération et la différenciation rapide, et un synoptique plus proche de l'érythropoïèse 10,11 humain. Dans ce système, un grand nombre de cellules progénitrices érythroïdes à partir de foie fœtal de souris peuvent être facilement isolés par la purification en une seule étape de Ter119 (un marqueur pour les cellules érythroïdes matures) des érythroblastes négatifs. Au cours de la culture de deux jours des érythroblastes, la différenciation de ces cellules peut être surveillée par une analyse par cytométrie de flux sur la base de l'expression en surface du récepteur de la transferrine (CD71) et l'antigène de Ter119 12. En outre, des érythroblastes énucléation de différenciation terminale peut être détectée par un fabricant de l'ADN (Hoechst 33 342) 13. En outre, les progéniteurs purifiés peuvent être génétiquement modifiées par expression d'ADNc exogène ou de petits ARN en épingle à cheveux (shRNA) pour les gènes d'intérêt, ce qui facilite les études mécanistiques des fonctions de l'expression du gène sur l'érythropoïèse 11,13,14.
D'autre part, le taux de croissance de cellule rapide peut être une arme à double tranchant, car il est difficile de caractériser les fonctions des gènes à différents stades de l'érythropoïèse terminale. Dans la plupart des cas, il est difficile de déterminer si une des fonctions des gènes spécifiques à un stade précoce de l'érythropoïèse terminale depuis le temps des ADNc ou shRNA exprimés, les cellules ont déjà passé le stade précoce. Pour résoudre ce problème, nous avons développé un système unique pour disséquer les stades précoces et tardifs de l'érythropoïèse terminale. Pour le stade précoce de l'érythropoïèse terminale, Ter119 érythroblastes négatifs génétiquement modifiés ont été cultivées dans un milieu sans Epo mais contenant du facteur de cellules souches (SCF), l'IL-6 et FLT3ligand de maintenir leur statut de géniteur et laissez les ADNc transduites ou shRNA à l'expression 13. Les cellules ont été modifiées pour l'Epo contenant le milieu après 12 heures pour induire la prolifération et la différenciation cellulaire. De cette façon, lorsque les cellules ont commencé à se différencier, les ADNc ont été transduites ou shRNA déjà exprimé. Pour la phase tardive de l'érythropoïèse terminale, Ter119 érythroblastes négatives ont été cultivées dans un milieu contenant de l'Epo immédiatement après la transduction. Par conséquent, on peut analyser les fonctions des gènes d'intérêt dans la phase tardive de l'érythropoïèse terminale. En résumé, une large application de ce système aiderait les fonctions des gènes disséquer à différents stades de l'érythropoïèse terminale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous présentons ici un système unique d'analyser chronologiquement fœtus de souris érythropoïèse terminale du foie. Grâce à l'application de différentes conditions de culture, nous avons disséqué avec succès l'érythropoïèse terminale en début et en fin. Ceci est particulièrement important pour déterminer les mécanismes de gènes ayant des fonctions multiples. Par exemple, GTPases Rac jouent un rôle important dans les différentes étapes de l'érythropoïèse terminale. L'inhibiti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par le NIH R00HL102154, et un American Society of Hematology prix de savant à P Ji.
Materials
| Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
| b-mecaptoethanol | Sigma | M6250 | 0.1 M in IMDM, 4℃stock |
| Penicillin-Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | 100 X |
| L-Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
| Stem cell factor (SCF) | STEMCELL TECH | 2630 | 100 ng/ul, -20℃ stock |
| Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6) | GEMINI Bio-product | 300-327P | |
| fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% stock in IMDM |
| Insulin solution, human | Sigma | I9278 | 4℃ stock |
| holo-transferrin human | Sigma | T0665 | 50 mg/ml in Water -20℃ stock |
| Erythropoietin(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3,000 U/ml stock |
| Streptavidin particles Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
| Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml | FALCON | 352063 |
References
- Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications. Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).
- Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L. Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin. Trends in cell biology. 15 (3), 146-155 (2005).
- Eshghi, S., Vogelezang, M. G., Hynes, R. O., Griffith, L. G., Lodish, H. F. Alpha4beta1 integrin and erythropoietin mediate temporally distinct steps in erythropoiesis: integrins in red cell development. The Journal of cell biology. 177 (5), 871-880 (2007).
- Koury, M. J., Bondurant, M. C. Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cells. Journal of cellular physiology. 137 (1), 65-74 (1988).
- Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., Lodish, H. F. Histone deacetylase 2 is required for chromatin condensation and subsequent enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts. Haematologica. 95 (12), 2013-2021 (2010).
- Dumitriu, B., et al. Sox6 cell-autonomously stimulates erythroid cell survival, proliferation, and terminal maturation and is thereby an important enhancer of definitive erythropoiesis during mouse development. Blood. 108 (4), 1198-1207 (2006).
- Rector, K., Liu, Y., Van Zant, G. Comprehensive hematopoietic stem cell isolation methods. Methods in molecular biology. 976, 1-15 (2013).
- Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in molecular biology. 750, 47-59 (2011).
- Choi, H. S., Lee, E. M., Kim, H. O., Park, M. I., Baek, E. J. Autonomous control of terminal erythropoiesis via physical interactions among erythroid cells. Stem cell research. 10 (3), 442-453 (2013).
- Bhatia, H., et al. Short-chain fatty acid-mediated effects on erythropoiesis in primary definitive erythroid cells. Blood. 113 (25), 6440-6448 (2009).
- Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
- Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
- Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nature cell biology. 10 (3), 314-321 (2008).
- Chida, D., Miura, O., Yoshimura, A., Miyajima, A. Role of cytokine signaling molecules in erythroid differentiation of mouse fetal liver hematopoietic cells: functional analysis of signaling molecules by retrovirus-mediated expression. Blood. 93 (5), 1567-1578 (1999).
- Patel, V. P., Lodish, H. F. A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes. The Journal of cell biology. 105 (6 Pt 2), 3105-3118 (1987).
- Udupa, K. B., Lipschitz, D. A. Endotoxin-induced suppression of erythropoiesis: the role of erythropoietin and a heme synthesis stimulating factor. Blood. 59 (6), 1267-1271 (1982).
- Koury, M. J., Sawyer, S. T., Brandt, S. J. New insights into erythropoiesis. Current opinion in hematology. 9 (2), 93-100 (2002).
