Preparación de sináptica Membrana plasmática y proteínas postsináptica densidad utilizando un gradiente discontinuo de sacarosa
Summary
Este artículo detalla el enriquecimiento de las proteínas asociadas con la membrana plasmática sináptica por ultracentrifugación en un gradiente discontinuo de sacarosa. También se describe la preparación posterior de las proteínas de densidad post-sináptica. Preparaciones de proteínas son adecuados para el Western Blot o análisis DIGE 2D.
Abstract
Técnicas de fraccionamiento subcelular neuronales permiten la cuantificación de proteínas que son objeto de trata hacia y desde la sinapsis. Como se describió originalmente en la década de 1960, las proteínas asociadas con la membrana plasmática sináptica se pueden aislar mediante ultracentrifugación en un gradiente de densidad de sacarosa. Una vez que se aislaron las membranas sinápticas, el complejo macromolecular conocido como la densidad post-sináptica puede ser posteriormente aislado debido a su insolubilidad detergente. Las técnicas usadas para aislar las membranas plasmáticas sinápticas y proteínas de densidad post-sinápticas siguen siendo esencialmente la misma después de 40 años, y se utilizan ampliamente en la investigación neurocientífica actual. Este artículo detalla el fraccionamiento de las proteínas asociadas con la membrana plasmática sináptica y post-sináptica densidad utilizando un gradiente discontinuo de sacarosa. Preparaciones de proteínas resultantes son adecuadas para el Western Blot o análisis DIGE 2D.
Introduction
Las neuronas se comunican a través de las sinapsis, y la calidad de esta comunicación está regulada en gran medida por las alteraciones en la composición de las proteínas en la sinapsis. En particular, las proteínas localizadas en la densidad post-sináptica participan en la comunicación neuronal por receptores de neurotransmisores íntimamente andamiaje con sus sistemas de transducción de señales 1. Además, los cambios duraderos en la fuerza de la eficacia sináptica son controlados por la adición o eliminación de los receptores a la densidad post-sináptica 1-6. Por lo tanto, el aislamiento y la cuantificación de las proteínas sinápticas es una técnica necesaria y útil para comprender mejor la forma en que las neuronas responden a estímulos y alterar la eficacia sináptica 7. Este artículo describe una técnica común para aislar proteínas sinápticas de tejido cerebral de roedor por ultracentrifugación en gradientes de sacarosa discontinuos. La fracción de membrana plasmática sináptica puede ser enriquecido y aislado basándose en elsu densidad en sacarosa, que ha sido determinado empíricamente para ser similar a 1.2 M de sacarosa.
Dependiendo de la pregunta biológica, fracciones subcelulares se pueden separar por gradientes continuos o discontinuos de Percoll, ya sea sacarosa o. Gradientes continuos permiten la separación de las proteínas en fracciones múltiples; esto puede ser particularmente útil para demostrar la co-localización de las proteínas dentro de una fracción dada 8. Sin embargo, la preparación de gradientes continuos es más laborioso y no es necesaria para muchas aplicaciones. Gradientes discontinuos son comparativamente más fáciles de preparar y se pueden utilizar para separar proteínas en unas pocas fracciones, definidos en general-. Gradientes discontinuos que están compuestos de tres capas de sacarosa de molaridad creciente han sido ampliamente utilizados para aislar proteínas asociadas con la membrana plasmática sináptica (SPM). Esta fracción de membrana plasmática sináptica se puede procesar adicionalmente a la fractio densidad post-sináptican (PSD) por tratamiento con detergente y el aislamiento de la fracción insoluble en detergente.
Cuando este proceso fue descrito por primera vez en el 1960 de 9,10, se utilizó microscopía electrónica para demostrar los orgánulos y membranas que definen aproximadamente la membrana plasmática sináptica y fracciones de densidad post-sináptica 9-14. Estos estudios demostraron la inclusión de membranas pre y post-sinápticas y vesículas sinápticas en la fracción SPM; después de tratamiento con detergente principalmente el electrón-densos, las densidades de post-sinápticas eran visibles. En el procedimiento, un choque hipotónico se utiliza para evitar el paso de los procesos sinápticos desde el cuerpo celular 10. Este paso se aprovecha del hecho de que las mitocondrias son más resistentes a choque osmótico y permanecen intactos, y por lo que se sedimentan en la parte inferior del gradiente de sacarosa (Figura 1).
Utilizando esta misma técnica de enriquecimiento, las fracciones de SPM y PSD fueron primero bioquímicamentedefinido por electroforesis en gel de poliacrilamida y la secuenciación de los principales componentes de la proteína de 15-17. El análisis de transferencia Western Posteriormente se ha utilizado para detectar y cuantificar los niveles de proteínas sinápticas y definir estas fracciones (Figura 2). Hemos utilizado esta técnica en nuestros laboratorios para cuantificar los cambios en los niveles sinápticos de transportador de dopamina que se producen cuando el locus SLC6A3 se duplica en ratones 18. También hemos utilizado esta técnica en ratones deficientes del receptor NMDA para descubrir reducciones sinápticos específicos en las proteínas que forman parte de la interactome DISC1 19.
Es evidente a partir de análisis de transferencia Western que las fracciones SPM contienen proteínas sinápticas membrana de la vesícula, marcadores endosoma, proteínas asociadas a la membrana mitocondrial, enzimas sintéticas y moléculas de transducción de señales, así como componentes integrales de la densidad post-sináptica y las membranas plasmáticas sinápticas 20-23. Efracciones PSD VEN pueden tener contaminación con abundantes proteínas mitocondriales y puede ser necesario realizar una segunda sedimentación gradiente o etapas de purificación adicionales para eliminarlos 13. Recientemente, la espectrometría de masas cuantitativa ha proporcionado una lista de más de 100 proteínas en la densidad post-sináptica solo, así como una indicación de la abundancia relativa de estos componentes 24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varios pasos en el proceso que son críticos para un resultado exitoso. En el paso 3, es importante que un grado consistente de homogeneización se logra para cada muestra. Cuando la homogeneización de tejido con el homogeneizador accionado por motor, una velocidad constante se utiliza no sólo para la rotación de la mano del mortero, pero también con el número de golpes. El tiempo de incubación durante el choque osmótico debe ser preciso, ya que la homogeneización ampliada o de la incubación en la solución…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).
Materials
| 1M HEPES, pH 7.4 | BioShop | HEP003.100 | |
| HEPES | BioShop | HEP001.500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507.1 | |
| EDTA | BioBasic | EB0185 | |
| PMSF | BioShop | PMS123.5 | |
| Aprotinin | BioShop | APR600.1 | |
| Leupeptin | BioShop | LEU001.1 | |
| Pepstatin | BioShop | PEP605.5 | |
| Benzamidine | BioShop | BEN601.25 | |
| Sodium fluoride | BioShop | SFL001.100 | |
| Sodium pyrophosphate | BioShop | SPP310.100 | |
| Sodium orthovanadate | BioShop | SOV664.10 | |
| β-glycerophosphate | BioShop | GYP001.10 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX506.500 | |
| 18G x 1 ½” needle | BD | 305196 | |
| 1cc syringe | BD | 309659 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog number | |
| Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23 | VWR | KT885450-0023 | |
| IKA Model RW 16 Basic Stirrer | IKA Works | 2572100 | |
| Sorvall SM-24 Fixed Angle Rotor | ThermoScientific | 29017 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | ThermoScientific | 46910 | |
| Thinwall Polyallomer Tubes (13.2mL) | Beckman Coulter | 331372 | |
| SW 41 Ti Rotor Swinging Bucket | Beckman Coulter | 331362 | |
| Beckman L-80 Floor Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Thickwall Polycarbonate Tubes (3.5mL) | Beckman Coulter | 349622 | |
| TLA-100.3 Fixed Angle Rotor | Beckman Coulter | 349481 | |
| Beckman TL-100 Tabletop Ultracentrifuge | Beckman Coulter |
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