إعداد متشابك غشاء البلازما والبروتينات الكثافة بعد المشبكي باستخدام التدرج السكروز متقطع
Summary
تفاصيل هذه المادة في إثراء البروتينات المرتبطة متشابك غشاء البلازما بواسطة تنبيذ فائق على التدرج السكروز متقطع. كما يوصف إعداد لاحق من البروتينات كثافة بعد متشابك. الاستعدادات البروتين هي مناسبة لالنشاف الغربي أو تحليل 2D DIGE.
Abstract
تقنيات تجزئة التحت خلوية العصبية تسمح الكمي من البروتينات التي يتم الاتجار من وإلى المشبك. كما هو موضح في الأصل في أواخر عام 1960، البروتينات المرتبطة متشابك غشاء البلازما يمكن عزلها بواسطة تنبيذ فائق على التدرج كثافة السكروز. مرة واحدة يتم عزل الأغشية متشابك، مجمع الجزيئات المعروفة باسم الكثافة آخر متشابك يمكن عزل لاحقا بسبب إينسولوبيليتي المنظفات لها. لا تزال التقنيات المستخدمة لعزل أغشية البلازما والبروتينات متشابك كثافة بعد متشابك في الأساس نفسه بعد 40 عاما، وتستخدم على نطاق واسع في أبحاث علم الأعصاب الحالي. تفاصيل هذه المقالة تجزئة البروتينات المرتبطة متشابك غشاء البلازما وكثافة بعد متشابك يستخدم التدرج السكروز متقطع. مما أدى الاستعدادات البروتين هي مناسبة لالنشاف الغربي أو تحليل 2D DIGE.
Introduction
الخلايا العصبية التواصل من خلال نقاط الاشتباك العصبي، وينظم نوعية هذا التواصل إلى حد كبير تغييرات في تكوين البروتينات في المشبك. على وجه الخصوص، والبروتينات الموجودة في كثافة بعد متشابك تشارك في الاتصالات العصبية من مستقبلات الناقل العصبي السقالات وثيق مع أنظمة نقل الإشارة الخاصة بهم 1. وعلاوة على ذلك، يتم التحكم التغييرات دائمة في قوة فعالية متشابك من خلال إضافة أو إزالة مستقبلات في كثافة بعد متشابك 1-6. ولذلك، فإن العزلة والكمي للبروتينات متشابك هي تقنية ضرورية ومفيدة لاكتساب نظرة ثاقبة الطرق أن الخلايا العصبية تستجيب للمنبهات وتغيير فعالية متشابك 7. توضح هذه المقالة تقنية شائعة لعزل البروتينات متشابك من أنسجة الدماغ عن طريق القوارض تنبيذ فائق على التدرجات السكروز متقطع. في جزء متشابك غشاء البلازما يمكن إثراء والمعزولة على أساسكثافته في السكروز، والتي تم تحديدها تجريبيا لتكون مشابهة إلى 1.2 M السكروز.
اعتمادا على هذه المسألة البيولوجية، والكسور التحت خلوية يمكن فصلها عن طريق التدرجات مستمرة أو متقطعة إما السكروز أو Percoll. التدرجات مستمرة تسمح لفصل البروتينات إلى كسور متعددة؛ هذا يمكن أن يكون مفيدا بشكل خاص للتدليل على المشاركة في توطين البروتينات داخل جزء معين 8. ومع ذلك، فإن إعداد التدرجات مستمرة أكثر شاقة وغير ضروري للعديد من التطبيقات. التدرجات متقطعة هي أسهل نسبيا للتحضير، ويمكن استخدامها لفصل البروتينات إلى بضع، والكسور يعرف عموما. التدرجات المتقطعة التي تتألف من ثلاث طبقات السكروز زيادة المولية وقد استخدمت على نطاق واسع لعزل البروتينات المرتبطة متشابك غشاء البلازما (SPM). هذا جزء متشابك غشاء البلازما يمكن معالجتها إلى مزيد من fractio كثافة بعد متشابكن (PSD) عن طريق العلاج المنظفات وعزل جزء المنظفات غير قابلة للذوبان.
عندما كان أول وصف هذه العملية في 9،10 في عام 1960، تم استخدام المجهر الإلكتروني لإثبات عضيات والأغشية التي تحدد تقريبا غشاء البلازما متشابك والكسور كثافة بعد متشابك 9-14. وأظهرت هذه الدراسات إدراج الأغشية قبل وبعد متشابك والحويصلات المشبكية في جزء SPM. بعد العلاج المنظفات في المقام الأول على الإلكترون الكثيفة، كانت كثافة بعد متشابك مرئية. في الإجراء، يتم استخدام صدمة ناقص التوتر لقرصة قبالة عمليات متشابك من خلايا الجسم 10. هذه الخطوة يستفيد من حقيقة أن الميتوكوندريا هي أكثر مقاومة للصدمة التناضحي وتبقى سليمة، وحتى الرواسب في قاع التدرج السكروز (الشكل 1).
باستخدام هذه التقنية نفس تخصيب، كانت SPM وPSD الكسور أولا كيميائيايحددها الكهربائي هلام بولي أكريلاميد وتسلسل مكونات البروتين الرئيسية 15-17. وقد استخدم تحليل لطخة الغربي في وقت لاحق لكشف وقياس مستويات البروتينات متشابك وتحديد هذه الكسور أكثر (الشكل 2). وقد استخدمنا هذه التقنية في مختبراتنا لقياس التغيرات في مستويات متشابك من نقل الدوبامين التي تحدث عند تكرار موضع Slc6a3 في الفئران 18. وقد استخدمنا هذه التقنية أيضا في NMDA مستقبلات الفئران ناقصة لكشف المشبك تخفيضات محددة في البروتينات التي هي جزء من interactome DISC1 19.
ويتضح من تحليل لطخة غربية أن الكسور SPM تحتوي على البروتينات متشابك غشاء الحويصلة، وعلامات دخلول؛ جسيم داخلي، بروتينات الميتوكوندريا، غشاء المرتبطة الاصطناعية الانزيمات والجزيئات نقل الإشارة، فضلا عن عناصر لا تتجزأ من كثافة بعد متشابك والأغشية البلازما متشابك 20-23. Eيمكن الكسور PSD فين يكون التلوث مع بروتينات الميتوكوندريا وفيرة، وأنه قد يكون من الضروري إجراء الترسيب التدرج الثاني أو خطوات تنقية إضافية لإزالتها 13. مؤخرا، قدمت الطيف الكتلي الكمي قائمة تضم أكثر من 100 البروتينات في كثافة بعد متشابك وحدها، وكذلك مؤشرا على الوفرة النسبية لهذه المكونات 24،25.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك العديد من الخطوات في الإجراء التي تعتبر بالغة الأهمية لتحقيق نتيجة ناجحة. في الخطوة 3، فمن المهم أن يتم التوصل إلى درجة من التجانس متسقة لكل عينة. عندما المجانسة الأنسجة مع بالمواتير الخالط، ويستخدم بسرعة ثابتة ليس فقط بالنسبة للدوران مدقة، ولكن أيضا مع عدد من ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).
Materials
| 1M HEPES, pH 7.4 | BioShop | HEP003.100 | |
| HEPES | BioShop | HEP001.500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507.1 | |
| EDTA | BioBasic | EB0185 | |
| PMSF | BioShop | PMS123.5 | |
| Aprotinin | BioShop | APR600.1 | |
| Leupeptin | BioShop | LEU001.1 | |
| Pepstatin | BioShop | PEP605.5 | |
| Benzamidine | BioShop | BEN601.25 | |
| Sodium fluoride | BioShop | SFL001.100 | |
| Sodium pyrophosphate | BioShop | SPP310.100 | |
| Sodium orthovanadate | BioShop | SOV664.10 | |
| β-glycerophosphate | BioShop | GYP001.10 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX506.500 | |
| 18G x 1 ½” needle | BD | 305196 | |
| 1cc syringe | BD | 309659 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog number | |
| Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23 | VWR | KT885450-0023 | |
| IKA Model RW 16 Basic Stirrer | IKA Works | 2572100 | |
| Sorvall SM-24 Fixed Angle Rotor | ThermoScientific | 29017 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | ThermoScientific | 46910 | |
| Thinwall Polyallomer Tubes (13.2mL) | Beckman Coulter | 331372 | |
| SW 41 Ti Rotor Swinging Bucket | Beckman Coulter | 331362 | |
| Beckman L-80 Floor Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Thickwall Polycarbonate Tubes (3.5mL) | Beckman Coulter | 349622 | |
| TLA-100.3 Fixed Angle Rotor | Beckman Coulter | 349481 | |
| Beckman TL-100 Tabletop Ultracentrifuge | Beckman Coulter |
References
- Delint-Ramirez, I., et al. In vivo composition of NMDA receptor signaling complexes differs between membrane subdomains and is modulated by PSD-95 and PSD-93. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 8162-8170 (2010).
- Wang, Q., et al. The psychiatric disease risk factors DISC1 and TNIK interact to regulate synapse composition and function. Mol Psychiatry. 16, (2010).
- Ehlers, M. D. Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting. Neuron. 28, 511-525 (2000).
- Tomita, S., Fukata, M., Nicoll, R. A., Bredt, D. S. Dynamic interaction of stargazin-like TARPs with cycling AMPA receptors at synapses. Science. 303, 1508-1511 (2004).
- Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54, 447-460 (2007).
- Bats, C., Groc, L., Choquet, D. The interaction between Stargazin and PSD-95 regulates AMPA receptor surface trafficking. Neuron. 53, 719-734 (2007).
- Ehlers, M. D. Activity level controls postsynaptic composition and signaling via the ubiquitin-proteasome system. Nat Neurosci. 6, 231-242 (2003).
- Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
- Rodriguez de Lores, A., Alberici, M., De Robertis, E. Ultrastructural and enzymic studies of cholinergic and non-cholinergic synaptic membranes isolated from brain cortex. Journal of Neurochemistry. 14, 215-225 (1967).
- Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J Anat. 96, 79-88 (1962).
- Cotman, C. W., Taylor, D. Isolation and structural studies on synaptic complexes from rat brain. J Cell Biol. 55, 696-711 (1972).
- Cotman, C. W., Banker, G., Churchill, L., Taylor, D. Isolation of postsynaptic densities from rat brain. The Journal of Cell Biology. 63, 441-455 (1974).
- Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities. The Journal of Cell Biology. 86, 831-845 (1980).
- Jones, D. H., Matus, A. I. Isolation of synaptic plasma membrane from brain by combined flotation-sedimentation density gradient centrifugation. Biochim Biophys Acta. 356, 276-287 (1974).
- Kennedy, M. B., Bennett, M. K., Erondu, N. E. Biochemical and immunochemical evidence that the “major postsynaptic density protein” is a subunit of a calmodulin-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80, 7357-7361 (1983).
- Moon, I. S., Apperson, M. L., Kennedy, M. B. The major tyrosine-phosphorylated protein in the postsynaptic density fraction is N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 3954-3958 (1994).
- Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4405-4410 (2008).
- Ma, D. K., et al. Neuronal activity-induced Gadd45b promotes epigenetic DNA demethylation and adult neurogenesis. Science. 323, 1074-1077 (2009).
- Budreck, E. C., Scheiffele, P. Neuroligin-3 is a neuronal adhesion protein at GABAergic and glutamatergic synapses. The European Journal of Neuroscience. 26, 1738-1748 (2007).
- Wu, J., et al. Arc/Arg3.1 regulates an endosomal pathway essential for activity-dependent beta-amyloid generation. Cell. 147, 615-628 (2011).
- Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation. J Cell Biol. 96, 1374-1388 (1983).
- Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity. Brain Res. 109, 285-309 (1976).
- Cheng, D., et al. Relative and absolute quantification of postsynaptic density proteome isolated from rat forebrain and cerebellum. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 5, 1158-1170 (2006).
- Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning : a Laboratory Manual. , (1989).
- Eggena, M., et al. Identification of histone H1 as a cognate antigen of the ulcerative colitis-associated marker antibody pANCA. J Autoimmun. 14, 83-97 (2000).
- Salahpour, A., et al. Homodimerization of the beta2-adrenergic receptor as a prerequisite for cell surface targeting. J Biol Chem. 279, 33390-33397 (2004).
- Bernocco, S., et al. Sequential detergent fractionation of primary neurons for proteomics studies. Proteomics. 8, 930-938 (2008).
- Grunewald, T. G., et al. Nuclear localization and cytosolic overexpression of LASP-1 correlates with tumor size and nodal-positivity of human breast carcinoma. BMC Cancer. 7, 198 (2007).
- Heimann, K., Percival, J. M., Weinberger, R., Gunning, P., Stow, J. L. Specific isoforms of actin-binding proteins on distinct populations of Golgi-derived vesicles. J Biol Chem. 274, 10743-10750 (1999).
- Neff, R. A., Gomez-Varela, D., Fernandes, C. C., Berg, D. K. Postsynaptic scaffolds for nicotinic receptors on neurons. Acta Pharmacol Sin. 30, 694-701 (2009).
- Cella, N., Cornejo-Uribe, R. R., Montes, G. S., Hynes, N. E., Chammas, R. The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novel differentiation marker for HC11 mouse mammary epithelial cells. Differentiation. 61, 113-120 (1996).
- Otera, H., et al. Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import. Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).
- Goubaeva, F., et al. Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).
- Lamers, K. J., et al. Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients. Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).
- Arunachalam, L., et al. Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells. Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).
- Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina. Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).
