Fremstilling af Synaptic plasmamembranen og postsynaptiske Density Proteiner hjælp af en Diskontinuerlig sucrosegradient
Summary
Denne artikel beskriver berigelsen af proteiner forbundet med den synaptiske plasmamembran ved ultracentrifugering på en diskontinuerlig saccharosegradient. Den efterfølgende udarbejdelse af postsynaptiske tæthed proteiner er også beskrevet. Protein præparater er egnede til western blotting eller 2D DIGE analyse.
Abstract
Neuronale subcellulære fraktioneringsteknikker tillader kvantificering af proteiner, der er handlet til og fra synapsen. Som oprindeligt beskrevet i slutningen af 1960'erne, kan proteiner, der er forbundet med den synaptiske plasmamembran isoleres ved ultracentrifugering på en sucrosemassefyldegradient. Når synaptiske membraner er isoleret, kan det makromolekylære kompleks kendt som den postsynaptiske tæthed efterfølgende isoleres på grund af sin vaskemiddel uopløselighed. De anvendte teknikker til at isolere synaptiske plasmamembraner og postsynaptiske tæthed proteiner forbliver stort set den samme efter 40 år, og er meget udbredt i de nuværende neurovidenskabelig forskning. Denne artikel beskriver fraktionering af proteiner, der er forbundet med det synaptiske plasmamembranen og postsynaptiske densitet ved hjælp af en diskontinuerlig saccharosegradient. Resulterende proteinpræparater er egnede til western blotting eller 2D DIGE analyse.
Introduction
Neuroner kommunikerer gennem synapser, og kvaliteten af denne meddelelse reguleres i vid udstrækning af ændringer i sammensætningen af proteiner ved synapsen. Især de proteiner, der ligger i den postsynaptiske tæthed deltage i neuronal kommunikation ved intim stilladser neurotransmitterreceptorer med deres signaltransduktionssystemer 1. Desuden er varige ændringer i styrken af synaptisk effektivitet kontrolleres ved tilsætning eller fjernelse af receptorer på den postsynaptiske tæthed 1-6. Derfor isolation og kvantificering af synaptiske proteiner er en nødvendig og nyttig teknik til at få indsigt i de måder, som neuroner reagerer på stimuli og ændre synaptisk effektivitet 7. Denne artikel beskriver en fælles teknik til at isolere synaptiske proteiner fra hjernevæv hos gnavere ved ultracentrifugering på diskontinuerte saccharosegradienter. Fraktionen Synaptic plasmamembran kan beriges og isoleres baseret pådens massefylde i saccharose, som er blevet empirisk bestemt til at være lig 1,2 M saccharose.
Afhængigt af den biologiske spørgsmål kan subcellulære fraktioner separeres ved kontinuerlige eller diskontinuerlige gradienter af enten saccharose eller Percoll. Kontinuerlige gradienter mulighed for adskillelse af proteiner i flere fraktioner; Dette kan især være nyttigt at påvise co-lokalisering af proteiner i en given fraktion 8. Men forberedelsen af kontinuerte gradienter er mere besværlig og er unødvendig for mange anvendelser. Diskontinuerlige gradienter er forholdsvis lettere at fremstille og kan anvendes til at separere proteiner ind i et par, generelt definerede fraktioner. Diskontinuerlige gradienter, der er sammensat af tre saccharose lag af stigende molaritet er ofte blevet brugt til at isolere proteiner associeret med synaptiske plasmamembranen (SPM). Denne fraktion synaptisk plasmamembran kan forarbejdes yderligere til den postsynaptiske tæthed fraction (PSD) med vaskemiddel behandling og isolation af fraktionen vaskemiddel-uopløselig.
Når denne fremgangsmåde blev først beskrevet i 1960 9,10 blev elektronmikroskopi anvendes til at vise organeller og membraner, der omtrent definerer synaptiske plasmamembranen og postsynaptiske tæthed fraktionerne 9-14. Disse undersøgelser viste, at medtage før og postsynaptiske membraner og synaptiske vesikler i fraktionen SPM; efter detergentbehandling primært elektron-tætte, postsynaptiske densiteter var synlige. I forbindelse med proceduren, er en hypotonisk chok bruges til at knibe off synaptiske processer fra cellen kroppen 10. Dette trin drager fordel af det faktum, at mitokondrier er mere modstandsdygtige over for osmotisk chok og forblive intakt, og så de sedimentere på bunden af saccharosegradienten (figur 1).
Brug af denne samme berigelse teknik, SPM og PSD fraktioner var først biokemiskdefineret ved polyacrylamidgelelektroforese og sekventering af de vigtigste proteinkomponenter 15-17. Efterfølgende western blot-analyse er blevet anvendt til at detektere og kvantificere niveauet af synaptiske proteiner, og yderligere at definere disse fraktioner (figur 2). Vi har anvendt denne teknik i vores laboratorier at kvantificere ændringer i de synaptiske niveauer af dopamin-transporteren, der opstår, når Slc6a3 locus duplikeret i mus 18. Vi har også brugt denne teknik i NMDA-receptor deficiente mus at afdække synapse-specifikke reduktioner i proteiner, der er en del af DISC1 interactome 19.
Det fremgår af western blot analyse, SPM fraktioner indeholder synaptiske vesikel membranproteiner, endosom markører, mitokondrielle proteiner, membranassocierede syntetiske enzymer og signaltransduktionsmolekyler samt integrerede komponenter i den postsynaptiske tæthed og synaptiske plasmamembraner 20-23. EVen PSD fraktioner kan have kontaminering med rigelige mitokondrielle proteiner, og det kan være nødvendigt at udføre en anden gradient sedimentering eller yderligere oprensningstrin for at fjerne dem 13. For nylig har kvantitativ massespektrometri en liste over mere end 100 proteiner i den postsynaptiske tæthed alene, samt en angivelse af den relative forekomst af disse komponenter 24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er flere trin i proceduren, der er afgørende for et vellykket resultat. I trin 3, er det vigtigt, at en ensartet grad af homogenisering er opnået for hver prøve. Ved homogenisering af væv med motordrevet homogenisator er en konstant hastighed ikke kun anvendes til rotation af støderen, men også med antallet af slag. Inkubationstiden under osmotisk chok bør være præcis, da forlænget homogenisering eller inkubering i hypotonisk opløsning vil lysere mitokondrier og forurene SPM prøven.
<p class="jove_co…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).
Materials
| 1M HEPES, pH 7.4 | BioShop | HEP003.100 | |
| HEPES | BioShop | HEP001.500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507.1 | |
| EDTA | BioBasic | EB0185 | |
| PMSF | BioShop | PMS123.5 | |
| Aprotinin | BioShop | APR600.1 | |
| Leupeptin | BioShop | LEU001.1 | |
| Pepstatin | BioShop | PEP605.5 | |
| Benzamidine | BioShop | BEN601.25 | |
| Sodium fluoride | BioShop | SFL001.100 | |
| Sodium pyrophosphate | BioShop | SPP310.100 | |
| Sodium orthovanadate | BioShop | SOV664.10 | |
| β-glycerophosphate | BioShop | GYP001.10 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX506.500 | |
| 18G x 1 ½” needle | BD | 305196 | |
| 1cc syringe | BD | 309659 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog number | |
| Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23 | VWR | KT885450-0023 | |
| IKA Model RW 16 Basic Stirrer | IKA Works | 2572100 | |
| Sorvall SM-24 Fixed Angle Rotor | ThermoScientific | 29017 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | ThermoScientific | 46910 | |
| Thinwall Polyallomer Tubes (13.2mL) | Beckman Coulter | 331372 | |
| SW 41 Ti Rotor Swinging Bucket | Beckman Coulter | 331362 | |
| Beckman L-80 Floor Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Thickwall Polycarbonate Tubes (3.5mL) | Beckman Coulter | 349622 | |
| TLA-100.3 Fixed Angle Rotor | Beckman Coulter | 349481 | |
| Beckman TL-100 Tabletop Ultracentrifuge | Beckman Coulter |
References
- Delint-Ramirez, I., et al. In vivo composition of NMDA receptor signaling complexes differs between membrane subdomains and is modulated by PSD-95 and PSD-93. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 8162-8170 (2010).
- Wang, Q., et al. The psychiatric disease risk factors DISC1 and TNIK interact to regulate synapse composition and function. Mol Psychiatry. 16, (2010).
- Ehlers, M. D. Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting. Neuron. 28, 511-525 (2000).
- Tomita, S., Fukata, M., Nicoll, R. A., Bredt, D. S. Dynamic interaction of stargazin-like TARPs with cycling AMPA receptors at synapses. Science. 303, 1508-1511 (2004).
- Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54, 447-460 (2007).
- Bats, C., Groc, L., Choquet, D. The interaction between Stargazin and PSD-95 regulates AMPA receptor surface trafficking. Neuron. 53, 719-734 (2007).
- Ehlers, M. D. Activity level controls postsynaptic composition and signaling via the ubiquitin-proteasome system. Nat Neurosci. 6, 231-242 (2003).
- Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
- Rodriguez de Lores, A., Alberici, M., De Robertis, E. Ultrastructural and enzymic studies of cholinergic and non-cholinergic synaptic membranes isolated from brain cortex. Journal of Neurochemistry. 14, 215-225 (1967).
- Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J Anat. 96, 79-88 (1962).
- Cotman, C. W., Taylor, D. Isolation and structural studies on synaptic complexes from rat brain. J Cell Biol. 55, 696-711 (1972).
- Cotman, C. W., Banker, G., Churchill, L., Taylor, D. Isolation of postsynaptic densities from rat brain. The Journal of Cell Biology. 63, 441-455 (1974).
- Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities. The Journal of Cell Biology. 86, 831-845 (1980).
- Jones, D. H., Matus, A. I. Isolation of synaptic plasma membrane from brain by combined flotation-sedimentation density gradient centrifugation. Biochim Biophys Acta. 356, 276-287 (1974).
- Kennedy, M. B., Bennett, M. K., Erondu, N. E. Biochemical and immunochemical evidence that the “major postsynaptic density protein” is a subunit of a calmodulin-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80, 7357-7361 (1983).
- Moon, I. S., Apperson, M. L., Kennedy, M. B. The major tyrosine-phosphorylated protein in the postsynaptic density fraction is N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 3954-3958 (1994).
- Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4405-4410 (2008).
- Ma, D. K., et al. Neuronal activity-induced Gadd45b promotes epigenetic DNA demethylation and adult neurogenesis. Science. 323, 1074-1077 (2009).
- Budreck, E. C., Scheiffele, P. Neuroligin-3 is a neuronal adhesion protein at GABAergic and glutamatergic synapses. The European Journal of Neuroscience. 26, 1738-1748 (2007).
- Wu, J., et al. Arc/Arg3.1 regulates an endosomal pathway essential for activity-dependent beta-amyloid generation. Cell. 147, 615-628 (2011).
- Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation. J Cell Biol. 96, 1374-1388 (1983).
- Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity. Brain Res. 109, 285-309 (1976).
- Cheng, D., et al. Relative and absolute quantification of postsynaptic density proteome isolated from rat forebrain and cerebellum. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 5, 1158-1170 (2006).
- Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning : a Laboratory Manual. , (1989).
- Eggena, M., et al. Identification of histone H1 as a cognate antigen of the ulcerative colitis-associated marker antibody pANCA. J Autoimmun. 14, 83-97 (2000).
- Salahpour, A., et al. Homodimerization of the beta2-adrenergic receptor as a prerequisite for cell surface targeting. J Biol Chem. 279, 33390-33397 (2004).
- Bernocco, S., et al. Sequential detergent fractionation of primary neurons for proteomics studies. Proteomics. 8, 930-938 (2008).
- Grunewald, T. G., et al. Nuclear localization and cytosolic overexpression of LASP-1 correlates with tumor size and nodal-positivity of human breast carcinoma. BMC Cancer. 7, 198 (2007).
- Heimann, K., Percival, J. M., Weinberger, R., Gunning, P., Stow, J. L. Specific isoforms of actin-binding proteins on distinct populations of Golgi-derived vesicles. J Biol Chem. 274, 10743-10750 (1999).
- Neff, R. A., Gomez-Varela, D., Fernandes, C. C., Berg, D. K. Postsynaptic scaffolds for nicotinic receptors on neurons. Acta Pharmacol Sin. 30, 694-701 (2009).
- Cella, N., Cornejo-Uribe, R. R., Montes, G. S., Hynes, N. E., Chammas, R. The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novel differentiation marker for HC11 mouse mammary epithelial cells. Differentiation. 61, 113-120 (1996).
- Otera, H., et al. Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import. Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).
- Goubaeva, F., et al. Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).
- Lamers, K. J., et al. Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients. Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).
- Arunachalam, L., et al. Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells. Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).
- Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina. Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).
