Voorbereiding van Synaptic plasmamembraan en Postsynaptische Density eiwitten met behulp van een discontinue sucrosegradiënt
Summary
Dit artikel beschrijft de verrijking van eiwitten geassocieerd met de synaptische plasmamembraan door ultracentrifugatie op een discontinue sucrose gradiënt. De verdere uitwerking van postsynaptische dichtheid eiwit wordt ook beschreven. Eiwitpreparaten zijn geschikt voor western blotting of 2D DIGE analyse.
Abstract
Neuronale subcellulaire fractionering technieken maken de kwantificering van eiwitten die worden verhandeld en naar de synaps. Zoals oorspronkelijk beschreven in de late 1960's kunnen eiwitten geassocieerd met de synaptische plasmamembraan door ultracentrifugatie worden geïsoleerd op een sucrose dichtheidsgradiënt. Zodra synaptische membranen worden geïsoleerd, kan de macromoleculaire complex bekend als de post-synaptische dichtheid vervolgens worden geïsoleerd door zijn onoplosbaarheid detergent. De technieken om synaptische plasmamembranen en postsynaptische dichtheid isolaat blijft in wezen hetzelfde na 40 jaar, en worden veel gebruikt in de huidige neurologieonderzoek. Dit artikel beschrijft de fractionering van eiwitten geassocieerd met de synaptische plasmamembraan en postsynaptische dichtheid met een discontinue sucrose gradiënt. Resulterende eiwit voorbereidingen zijn geschikt voor western blotting of 2D DIGE analyse.
Introduction
Neuronen communiceren via synapsen, en de kwaliteit van deze communicatie wordt voor een groot deel gereguleerd door veranderingen in de samenstelling van eiwitten in de synaps. Met name de eiwitten in het postsynaptische dichtheid deelnemen neuronale communicatie door innig steigers neurotransmitter receptoren met hun signaaltransductiesystemen 1. Bovendien blijvende veranderingen in de sterkte van synaptische werkzaamheid worden gecontroleerd door toevoeging of verwijdering van receptoren op postsynaptische dichtheid 1-6. Daarom is de isolatie en kwantificering van synaptische eiwitten is een noodzakelijke en nuttige techniek om inzicht te krijgen in de manieren waarop neuronen reageren op prikkels en synaptische werkzaamheid 7 veranderen. Dit artikel beschrijft een gebruikelijke techniek synaptische eiwitten uit hersenweefsel van knaagdieren isoleren door ultracentrifugatie op discontinue sucrosegradiënten. De synaptische plasmamembraan fractie verrijkt kan worden en geïsoleerd op basisde dichtheid van sucrose, die is empirisch bepaald Soortgelijke 1,2 M sucrose is.
Afhankelijk van de biologische vraag kan subcellulaire fracties worden gescheiden door continue of discontinue gradiënten van hetzij sucrose of Percoll. Continue gradiënten kan een scheiding van eiwitten in meerdere fracties; Dit kan bijzonder nuttig zijn om de co-lokalisatie van eiwitten in een bepaalde fractie 8 demonstreren. De bereiding van continue gradiënten is bewerkelijker en behoeft voor vele toepassingen. Discontinue gradiënten relatief gemakkelijker te bereiden en kunnen worden gebruikt om proteïnen in een aantal, in hoofdzaak gedefinieerde fracties te scheiden. Discontinue gradiënten die bestaan uit drie lagen sucrose verhogen molariteit zijn op grote schaal gebruikt om eiwitten geassocieerd met de synaptische plasmamembraan (SPM) te isoleren. Deze synaptische plasmamembraan fractie kan verder worden verwerkt om de postsynaptische dichtheid fractioneringn (PSD) van detergens behandeling en isolatie van het detergens-oplosbare fractie.
Wanneer dit proces eerst beschreven in 1960 9,10, elektronenmicroscopie werd gebruikt om de organellen en membranen die ongeveer synaptische plasmamembraan en postsynaptische dichtheid fracties 9-14 definiëren tonen. Deze studies toonden de opname vóór en postsynaptische membranen en synaptische blaasjes in de SPM fractie; na detergensbehandeling primair elektron-dichte, postsynaptische dichtheden zichtbaar. In de procedure wordt een hypotone shock gebruikt knijpen de synaptische processen van het cellichaam 10. Deze stap maakt gebruik van het feit dat mitochondriën zijn bestand tegen osmotische shock en intact blijven en zijn dus sedimenteren op de bodem van de sucrose gradiënt (figuur 1).
Met deze zelfde verrijking techniek SPM en de PSD fracties werden eerst biochemischbepaald door polyacrylamide gel elektroforese en sequentiebepaling van de belangrijkste eiwitbestanddelen 15-17. Vervolgens western blot analyse werd gebruikt voor het detecteren en kwantificeren van de niveaus van synaptische eiwitten en definieert deze fracties verder (figuur 2). Wij hebben deze techniek in onze laboratoria veranderingen in de synaptische niveaus van de dopamine transporter die optreden wanneer de Slc6a3 locus gedupliceerd in muizen 18 kwantificeren. We hebben ook deze techniek NMDA receptor deficiënte muizen synaps-specifieke verlaging van eiwitten die deel uitmaken van de DISC1 interactoom 19 ontdekken.
Blijkens western blot analyse SPM fracties bevatten synaptische vesicles membraaneiwitten, endosoom markers, mitochondriale eiwitten, membraangeassocieerd synthetische enzymen en signaaltransductie moleculen, alsmede integrale componenten van de postsynaptische dichtheid en synaptische plasmamembranen 20-23. Even PSD fracties kan verontreiniging met overvloedige mitochondriale eiwitten en kan het nodig zijn een tweede gradiënt sedimentatie of extra zuiveringsstappen uitgevoerd dat ze 13 verwijderen. Onlangs heeft kwantitatieve massaspectrometrie een lijst van meer dan 100 eiwitten in het postsynaptische dichtheid alleen, alsmede een indicatie van de relatieve abundantie van deze componenten 24,25 ontvangen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn verschillende stappen in de procedure die van cruciaal belang voor een succesvol resultaat zijn. In stap 3, is het belangrijk dat een consistente mate van homogenisatie wordt verkregen voor elk monster. Bij homogeniseren weefsel met de motor aangedreven homogenisator, wordt een constante snelheid niet alleen de rotatie van de stamper, maar ook het aantal slagen. De incubatietijd tijdens de osmotische shock dient precies te zijn, aangezien de verlenging van homogenisering of incubatie in de hypotone oplossing mit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).
Materials
| 1M HEPES, pH 7.4 | BioShop | HEP003.100 | |
| HEPES | BioShop | HEP001.500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507.1 | |
| EDTA | BioBasic | EB0185 | |
| PMSF | BioShop | PMS123.5 | |
| Aprotinin | BioShop | APR600.1 | |
| Leupeptin | BioShop | LEU001.1 | |
| Pepstatin | BioShop | PEP605.5 | |
| Benzamidine | BioShop | BEN601.25 | |
| Sodium fluoride | BioShop | SFL001.100 | |
| Sodium pyrophosphate | BioShop | SPP310.100 | |
| Sodium orthovanadate | BioShop | SOV664.10 | |
| β-glycerophosphate | BioShop | GYP001.10 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX506.500 | |
| 18G x 1 ½” needle | BD | 305196 | |
| 1cc syringe | BD | 309659 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog number | |
| Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23 | VWR | KT885450-0023 | |
| IKA Model RW 16 Basic Stirrer | IKA Works | 2572100 | |
| Sorvall SM-24 Fixed Angle Rotor | ThermoScientific | 29017 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | ThermoScientific | 46910 | |
| Thinwall Polyallomer Tubes (13.2mL) | Beckman Coulter | 331372 | |
| SW 41 Ti Rotor Swinging Bucket | Beckman Coulter | 331362 | |
| Beckman L-80 Floor Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Thickwall Polycarbonate Tubes (3.5mL) | Beckman Coulter | 349622 | |
| TLA-100.3 Fixed Angle Rotor | Beckman Coulter | 349481 | |
| Beckman TL-100 Tabletop Ultracentrifuge | Beckman Coulter |
References
- Delint-Ramirez, I., et al. In vivo composition of NMDA receptor signaling complexes differs between membrane subdomains and is modulated by PSD-95 and PSD-93. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 8162-8170 (2010).
- Wang, Q., et al. The psychiatric disease risk factors DISC1 and TNIK interact to regulate synapse composition and function. Mol Psychiatry. 16, (2010).
- Ehlers, M. D. Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting. Neuron. 28, 511-525 (2000).
- Tomita, S., Fukata, M., Nicoll, R. A., Bredt, D. S. Dynamic interaction of stargazin-like TARPs with cycling AMPA receptors at synapses. Science. 303, 1508-1511 (2004).
- Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54, 447-460 (2007).
- Bats, C., Groc, L., Choquet, D. The interaction between Stargazin and PSD-95 regulates AMPA receptor surface trafficking. Neuron. 53, 719-734 (2007).
- Ehlers, M. D. Activity level controls postsynaptic composition and signaling via the ubiquitin-proteasome system. Nat Neurosci. 6, 231-242 (2003).
- Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
- Rodriguez de Lores, A., Alberici, M., De Robertis, E. Ultrastructural and enzymic studies of cholinergic and non-cholinergic synaptic membranes isolated from brain cortex. Journal of Neurochemistry. 14, 215-225 (1967).
- Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J Anat. 96, 79-88 (1962).
- Cotman, C. W., Taylor, D. Isolation and structural studies on synaptic complexes from rat brain. J Cell Biol. 55, 696-711 (1972).
- Cotman, C. W., Banker, G., Churchill, L., Taylor, D. Isolation of postsynaptic densities from rat brain. The Journal of Cell Biology. 63, 441-455 (1974).
- Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities. The Journal of Cell Biology. 86, 831-845 (1980).
- Jones, D. H., Matus, A. I. Isolation of synaptic plasma membrane from brain by combined flotation-sedimentation density gradient centrifugation. Biochim Biophys Acta. 356, 276-287 (1974).
- Kennedy, M. B., Bennett, M. K., Erondu, N. E. Biochemical and immunochemical evidence that the “major postsynaptic density protein” is a subunit of a calmodulin-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80, 7357-7361 (1983).
- Moon, I. S., Apperson, M. L., Kennedy, M. B. The major tyrosine-phosphorylated protein in the postsynaptic density fraction is N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 3954-3958 (1994).
- Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4405-4410 (2008).
- Ma, D. K., et al. Neuronal activity-induced Gadd45b promotes epigenetic DNA demethylation and adult neurogenesis. Science. 323, 1074-1077 (2009).
- Budreck, E. C., Scheiffele, P. Neuroligin-3 is a neuronal adhesion protein at GABAergic and glutamatergic synapses. The European Journal of Neuroscience. 26, 1738-1748 (2007).
- Wu, J., et al. Arc/Arg3.1 regulates an endosomal pathway essential for activity-dependent beta-amyloid generation. Cell. 147, 615-628 (2011).
- Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation. J Cell Biol. 96, 1374-1388 (1983).
- Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity. Brain Res. 109, 285-309 (1976).
- Cheng, D., et al. Relative and absolute quantification of postsynaptic density proteome isolated from rat forebrain and cerebellum. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 5, 1158-1170 (2006).
- Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning : a Laboratory Manual. , (1989).
- Eggena, M., et al. Identification of histone H1 as a cognate antigen of the ulcerative colitis-associated marker antibody pANCA. J Autoimmun. 14, 83-97 (2000).
- Salahpour, A., et al. Homodimerization of the beta2-adrenergic receptor as a prerequisite for cell surface targeting. J Biol Chem. 279, 33390-33397 (2004).
- Bernocco, S., et al. Sequential detergent fractionation of primary neurons for proteomics studies. Proteomics. 8, 930-938 (2008).
- Grunewald, T. G., et al. Nuclear localization and cytosolic overexpression of LASP-1 correlates with tumor size and nodal-positivity of human breast carcinoma. BMC Cancer. 7, 198 (2007).
- Heimann, K., Percival, J. M., Weinberger, R., Gunning, P., Stow, J. L. Specific isoforms of actin-binding proteins on distinct populations of Golgi-derived vesicles. J Biol Chem. 274, 10743-10750 (1999).
- Neff, R. A., Gomez-Varela, D., Fernandes, C. C., Berg, D. K. Postsynaptic scaffolds for nicotinic receptors on neurons. Acta Pharmacol Sin. 30, 694-701 (2009).
- Cella, N., Cornejo-Uribe, R. R., Montes, G. S., Hynes, N. E., Chammas, R. The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novel differentiation marker for HC11 mouse mammary epithelial cells. Differentiation. 61, 113-120 (1996).
- Otera, H., et al. Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import. Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).
- Goubaeva, F., et al. Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).
- Lamers, K. J., et al. Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients. Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).
- Arunachalam, L., et al. Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells. Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).
- Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina. Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).
