Préparation de Synaptic membrane plasmique et de protéines de densité post-synaptique en utilisant un gradient discontinu de saccharose
Summary
Cet article décrit l'enrichissement de protéines associées à la membrane plasmique synaptique par ultracentrifugation sur un gradient discontinu de saccharose. La préparation ultérieure des protéines de densités postsynaptiques est également décrite. préparations de protéines sont adaptés pour western blot ou analyse 2D DIGE.
Abstract
Techniques de fractionnement subcellulaire de neurones permettent la quantification de protéines que l'on traite et à partir de la synapse. Comme décrit à l'origine à la fin des années 1960, des protéines associées à la membrane plasmique synaptique peuvent être isolées par ultracentrifugation sur un gradient de densité de saccharose. Une fois les membranes synaptiques sont isolés, le complexe macromoléculaire appelé la densité post-synaptique peut être ensuite isolé en raison de son insolubilité de détergent. Les techniques utilisées pour isoler les membranes plasmiques synaptiques et les protéines de la densité post-synaptiques demeurent essentiellement les mêmes après 40 ans, et sont largement utilisés dans la recherche en neurosciences en cours. Cet article décrit le fractionnement de protéines associées à la membrane plasmique synaptique et la densité post-synaptique en utilisant un gradient discontinu de saccharose. Résultant des préparations de protéines sont adaptés pour western blot ou analyse 2D DIGE.
Introduction
Les neurones communiquent par des synapses, et la qualité de cette communication est régulé dans une large mesure par des modifications de la composition des protéines au niveau de la synapse. En particulier, les protéines qui se trouvent dans la densité post-synaptique des neurones participent à la communication par les récepteurs des neurotransmetteurs échafaudage intimement avec leurs systèmes de transduction de signaux 1. En outre, des modifications durables de la force de l'efficacité synaptique sont contrôlés par l'ajout ou le retrait de récepteurs à la densité post-synaptique 6.1. Par conséquent, l'isolement et la quantification des protéines synaptiques est une technique nécessaire et utile pour mieux comprendre la façon dont les neurones répondent à des stimuli et modifier l'efficacité synaptique 7. Cet article décrit une technique courante pour isoler les protéines synaptiques à partir de tissu cérébral des rongeurs par ultracentrifugation sur gradient de saccharose discontinu. La fraction de membrane synaptique de plasma peut être enrichie et isolées en se basant sursa densité en saccharose, qui a été déterminé de manière empirique pour être semblable à 1,2 M de saccharose.
En fonction de la question biologique, des fractions subcellulaires peuvent être séparés par des gradients continus ou discontinus de Percoll ou saccharose soit. Gradients continus pour permettre la séparation de protéines en plusieurs fractions; cela peut être particulièrement utile pour démontrer la co-localisation des protéines dans une fraction donnée 8. Cependant, la préparation de gradients continus est plus laborieux et n'est pas nécessaire pour de nombreuses applications. Gradients discontinus sont relativement plus faciles à préparer et peuvent être utilisées pour séparer les protéines en quelques fractions, généralement définies. Gradients discontinus qui sont composées de trois couches de saccharose d'augmenter la molarité ont été largement utilisés pour isoler les protéines associées à la membrane plasmique synaptique (SPM). Cette fraction synaptique de la membrane plasmatique peut être encore traitée pour la FRACTIO densité post-synaptiquen (PSD) par traitement avec un détergent et de l'isolement de la fraction insoluble dans le détergent.
Lorsque ce procédé a été décrit pour la première dans les années 1960, 9,10, la microscopie électronique a été utilisé pour démontrer les organelles et de membranes qui définissent approximativement la membrane plasmique synaptique et les fractions de densité post-synaptiques 9-14. Ces études ont démontré l'inclusion des membranes pré-et post-synaptiques et des vésicules synaptiques dans la fraction de SPM; après le traitement au détergent essentiellement la dense aux électrons, la densité post-synaptiques sont visibles. Dans la procédure, un choc hypotonique est utilisé pour pincer les processus synaptiques à partir du corps de la cellule 10. Cette étape prend avantage du fait que les mitochondries sont plus résistants aux chocs osmotiques et restent intacts, et ainsi ils sédimentent au fond du gradient de saccharose (figure 1).
En utilisant la même technique d'enrichissement, les SPM et PSD fractions ont d'abord été biochimiquementdéfini par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et la séquence des composantes majeures de protéines de 15 à 17. Par la suite l'analyse par transfert de Western a été utilisée pour détecter et quantifier le niveau de protéines synaptiques et en outre définir ces fractions (Figure 2). Nous avons utilisé cette technique dans nos laboratoires pour quantifier les changements dans les niveaux synaptiques du transporteur de la dopamine qui se produisent lorsque le lieu SLC6A3 est dupliqué chez la souris 18. Nous avons également utilisé cette technique dans les souris déficientes en récepteurs de NMDA pour découvrir la réduction spécifique à la synapse en protéines qui font partie de la DISC1 interactome 19.
Il est évident à partir de l'analyse western blot que les fractions SPM contiennent synaptiques protéines de la membrane des vésicules, des marqueurs de endosome, les protéines mitochondriales, associées à la membrane enzymes synthétiques et des molécules de transduction de signaux, ainsi que des parties intégrantes de la densité post-synaptique et les membranes de plasma synaptiques 20-23. Efractions PSD VEN peuvent avoir une contamination par des protéines mitochondriales abondantes et il peut être nécessaire d'effectuer une deuxième sédimentation de gradient ou des étapes supplémentaires de purification pour les 13 retirer. Récemment, la spectrométrie de masse quantitative a fourni une liste de plus de 100 protéines de la densité post-synaptique seul, ainsi qu'une indication de l'abondance relative de ces éléments 24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il ya plusieurs étapes de la procédure qui sont essentiels pour le succès. A l'étape 3, il est important qu'un certain degré de cohérence homogénéisation est obtenue pour chaque échantillon. Lorsque le tissu avec le moteur entraîné homogénéisateur homogénéisation, une vitesse constante est utilisée non seulement pour la rotation du pilon, mais également avec le nombre de coups. Le temps d'incubation au cours du choc osmotique doit être précise, car homogénéisation prolongée ou incubatio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).
Materials
| 1M HEPES, pH 7.4 | BioShop | HEP003.100 | |
| HEPES | BioShop | HEP001.500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507.1 | |
| EDTA | BioBasic | EB0185 | |
| PMSF | BioShop | PMS123.5 | |
| Aprotinin | BioShop | APR600.1 | |
| Leupeptin | BioShop | LEU001.1 | |
| Pepstatin | BioShop | PEP605.5 | |
| Benzamidine | BioShop | BEN601.25 | |
| Sodium fluoride | BioShop | SFL001.100 | |
| Sodium pyrophosphate | BioShop | SPP310.100 | |
| Sodium orthovanadate | BioShop | SOV664.10 | |
| β-glycerophosphate | BioShop | GYP001.10 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX506.500 | |
| 18G x 1 ½” needle | BD | 305196 | |
| 1cc syringe | BD | 309659 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog number | |
| Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23 | VWR | KT885450-0023 | |
| IKA Model RW 16 Basic Stirrer | IKA Works | 2572100 | |
| Sorvall SM-24 Fixed Angle Rotor | ThermoScientific | 29017 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | ThermoScientific | 46910 | |
| Thinwall Polyallomer Tubes (13.2mL) | Beckman Coulter | 331372 | |
| SW 41 Ti Rotor Swinging Bucket | Beckman Coulter | 331362 | |
| Beckman L-80 Floor Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Thickwall Polycarbonate Tubes (3.5mL) | Beckman Coulter | 349622 | |
| TLA-100.3 Fixed Angle Rotor | Beckman Coulter | 349481 | |
| Beckman TL-100 Tabletop Ultracentrifuge | Beckman Coulter |
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