एक असंतत सुक्रोज ढाल का उपयोग Synaptic प्लाज्मा झिल्ली और postsynaptic घनत्व प्रोटीन की तैयारी
Summary
यह लेख एक टूटनेवाला sucrose के ढाल पर ultracentrifugation द्वारा synaptic प्लाज्मा झिल्ली के साथ जुड़े प्रोटीन का संवर्धन का विवरण. बाद synaptic घनत्व प्रोटीन के बाद तैयारी भी वर्णन किया गया है. प्रोटीन की तैयारी पश्चिमी सोख्ता या 2 डी DIGE विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं.
Abstract
Neuronal subcellular fractionation तकनीक को और अन्तर्ग्रथन से तस्करी कर रहे हैं कि प्रोटीन की मात्रा का ठहराव अनुमति देते हैं. मूल रूप से 1960 देर में वर्णित है, synaptic प्लाज्मा झिल्ली के साथ जुड़े प्रोटीन एक sucrose के घनत्व ढाल पर ultracentrifugation द्वारा अलग किया जा सकता है. अन्तर्ग्रथनी झिल्ली अलग कर रहे हैं एक बार, बाद synaptic घनत्व के रूप में जाना macromolecular परिसर बाद में इसकी वजह से डिटर्जेंट जटिलता को अलग किया जा सकता है. अन्तर्ग्रथनी प्लाज्मा झिल्ली और बाद synaptic घनत्व प्रोटीन को अलग करने के लिए इस्तेमाल की तकनीक अनिवार्य रूप से 40 साल के बाद ही रहते हैं, और व्यापक रूप से वर्तमान तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में इस्तेमाल किया जाता है. यह लेख synaptic प्लाज्मा झिल्ली और बाद synaptic घनत्व एक टूटनेवाला sucrose के ढाल का प्रयोग से जुड़े प्रोटीन का विभाजन विवरण. परिणामस्वरूप प्रोटीन तैयारी पश्चिमी सोख्ता या 2 डी DIGE विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं.
Introduction
न्यूरॉन्स synapses के माध्यम से संवाद, और इस संचार की गुणवत्ता अन्तर्ग्रथन में प्रोटीन की संरचना में परिवर्तन से काफी हद तक नियंत्रित किया जाता है. विशेष रूप से, बाद synaptic घनत्व में स्थित प्रोटीन उनके संकेत पारगमन प्रणाली 1 के साथ परिचित मचान स्नायुसंचारी रिसेप्टर्स द्वारा न्यूरोनल संचार में भाग लेते हैं. इसके अलावा, synaptic प्रभावकारिता की ताकत में स्थायी परिवर्तन के बाद synaptic घनत्व 1-6 पर अतिरिक्त या रिसेप्टर्स को हटाने के द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं. इसलिए, synaptic प्रोटीन का अलगाव और मात्रा का ठहराव न्यूरॉन्स उत्तेजनाओं और synaptic प्रभावकारिता 7 में परिवर्तन करने के लिए जवाब है कि मायनों में जानकारी हासिल करने के लिए एक आवश्यक और उपयोगी तकनीक है. यह लेख टूटनेवाला सूक्रोज ढ़ाल पर ultracentrifugation द्वारा कृंतक मस्तिष्क के ऊतकों से synaptic प्रोटीन को अलग करने के लिए एक आम तकनीक का वर्णन है. अन्तर्ग्रथनी प्लाज्मा झिल्ली अंश को समृद्ध किया जा सकता है और पर आधारित पृथकअनुभव से 1.2 एम sucrose के लिए समान होने के लिए निर्धारित किया गया है जो सुक्रोज में इसकी घनत्व,.
जैविक सवाल पर निर्भर करता है, subcellular भिन्न सूक्रोज या Percoll या तो सतत या टूटनेवाला ढ़ाल के द्वारा अलग किया जा सकता है. सतत ढ़ाल कई भागों में प्रोटीन की जुदाई के लिए अनुमति देते हैं; इसमें दिए गए अंश 8 के भीतर प्रोटीन की सह स्थानीयकरण प्रदर्शित करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है. हालांकि, निरंतर ढ़ाल की तैयारी अधिक श्रमसाध्य है और कई अनुप्रयोगों के लिए अनावश्यक है. टूटनेवाला ढ़ाल तैयार करने के लिए अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं और कुछ ही, आम तौर पर परिभाषित भागों में प्रोटीन को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बढ़ती molarity के तीन सूक्रोज परतों से बना रहे हैं कि टूटनेवाला ढ़ाल व्यापक रूप से synaptic प्लाज्मा झिल्ली (एसपीएम) के साथ जुड़े प्रोटीन को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस synaptic प्लाज्मा झिल्ली अंश आगे बाद synaptic घनत्व fractio के लिए कार्रवाई की जा सकतीडिटर्जेंट अघुलनशील अंश का डिटर्जेंट उपचार और अलगाव से n (PSD).
इस प्रक्रिया पहले 1960 9,10 में वर्णित किया गया था, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी मोटे तौर पर synaptic प्लाज्मा झिल्ली और बाद synaptic घनत्व भिन्न 9-14 परिभाषित कि organelles और झिल्ली प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इन अध्ययनों से पूर्व और बाद अन्तर्ग्रथनी झिल्ली और एसपीएम अंश में synaptic पुटिका के शामिल किए जाने का प्रदर्शन किया; डिटर्जेंट उपचार मुख्यतः इलेक्ट्रॉन घने बाद, बाद synaptic घनत्व दिखाई दे रहे थे. प्रक्रिया में, एक hypotonic झटका सेल शरीर में 10 से synaptic प्रक्रियाओं चुटकी बंद किया जाता है. यह कदम माइटोकॉन्ड्रिया आसमाटिक सदमे के लिए प्रतिरोधी होते हैं और बरकरार रहेगा, और इसलिए वे sucrose ढाल (चित्रा 1) के तल पर तलछट कि तथ्य का लाभ लेता है.
यह वही संवर्धन तकनीक का उपयोग करना, एसपीएम और PSD भिन्न biochemically पहले थेpolyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन और प्रमुख प्रोटीन घटक 15-17 का अनुक्रमण से परिभाषित किया. इसके बाद पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (चित्रा 2) इन अंशों को परिभाषित आगे का पता लगाने और synaptic प्रोटीन के स्तर यों और करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हम Slc6a3 ठिकाना चूहों 18 में दोहराया गया है कि हो जब डोपामिन ट्रांसपोर्टर की synaptic स्तर में परिवर्तन यों हमारी प्रयोगशालाओं में इस तकनीक का इस्तेमाल किया है. हम भी DISC1 interactome 19 का हिस्सा हैं कि प्रोटीन में synapse विशेष कटौती को उजागर करने NMDA रिसेप्टर कमी चूहों में इस तकनीक का इस्तेमाल किया है.
यह एसपीएम भिन्न synaptic पुटिका झिल्ली प्रोटीन, endosome मार्कर, mitochondrial प्रोटीन, झिल्ली जुड़े सिंथेटिक एंजाइम और संकेत पारगमन अणु है, साथ ही बाद synaptic घनत्व का अभिन्न घटकों और synaptic प्लाज्मा झिल्ली 20-23 होते हैं कि पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से स्पष्ट है. ईउपक्रम PSD भिन्न प्रचुर mitochondrial प्रोटीन के साथ संदूषण हो सकता है और यह उनके 13 को निकालने के लिए एक दूसरे की ढाल अवसादन या अतिरिक्त शुद्धि चरणों को पूरा करने के लिए आवश्यक हो सकता है. हाल ही में, मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री अकेले बाद synaptic घनत्व में 100 से अधिक प्रोटीन की एक सूची है, साथ ही इन घटकों 24,25 के रिश्तेदार बहुतायत का एक संकेत प्रदान की गई है.
Protocol
Representative Results
Discussion
एक सफल परिणाम के लिए महत्वपूर्ण हैं कि प्रक्रिया में कई कदम उठाए हैं. चरण 3 में, यह homogenization के अनुरूप एक डिग्री प्रत्येक नमूने के लिए हासिल की है कि महत्वपूर्ण है. मोटर चालित homogenizer साथ ऊतक homogenizing, जब एक स्थिर गति…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).
Materials
| 1M HEPES, pH 7.4 | BioShop | HEP003.100 | |
| HEPES | BioShop | HEP001.500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507.1 | |
| EDTA | BioBasic | EB0185 | |
| PMSF | BioShop | PMS123.5 | |
| Aprotinin | BioShop | APR600.1 | |
| Leupeptin | BioShop | LEU001.1 | |
| Pepstatin | BioShop | PEP605.5 | |
| Benzamidine | BioShop | BEN601.25 | |
| Sodium fluoride | BioShop | SFL001.100 | |
| Sodium pyrophosphate | BioShop | SPP310.100 | |
| Sodium orthovanadate | BioShop | SOV664.10 | |
| β-glycerophosphate | BioShop | GYP001.10 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX506.500 | |
| 18G x 1 ½” needle | BD | 305196 | |
| 1cc syringe | BD | 309659 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog number | |
| Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23 | VWR | KT885450-0023 | |
| IKA Model RW 16 Basic Stirrer | IKA Works | 2572100 | |
| Sorvall SM-24 Fixed Angle Rotor | ThermoScientific | 29017 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | ThermoScientific | 46910 | |
| Thinwall Polyallomer Tubes (13.2mL) | Beckman Coulter | 331372 | |
| SW 41 Ti Rotor Swinging Bucket | Beckman Coulter | 331362 | |
| Beckman L-80 Floor Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Thickwall Polycarbonate Tubes (3.5mL) | Beckman Coulter | 349622 | |
| TLA-100.3 Fixed Angle Rotor | Beckman Coulter | 349481 | |
| Beckman TL-100 Tabletop Ultracentrifuge | Beckman Coulter |
References
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