Preparazione di Synaptic membrana plasmatica e Proteine densità postsinaptica Utilizzo di un gradiente di saccarosio discontinuo
Summary
Questo articolo descrive l'arricchimento di proteine associate con la membrana plasmatica sinaptica da ultracentrifugazione su gradiente di saccarosio discontinuo. La successiva preparazione di proteine di densità post-sinaptica è anche descritto. Preparati proteici sono adatti per western blotting o l'analisi 2D DIGE.
Abstract
Neuronali tecniche di frazionamento subcellulare consentono la quantificazione di proteine che sono vittime della tratta da e per la sinapsi. Come originariamente descritto nel tardo 1960, proteine associate alla membrana plasmatica sinaptica possono essere isolati da ultracentrifugazione su gradiente di densità di saccarosio. Una volta membrane sinaptiche sono isolati, il complesso macromolecolare nota come la densità post-sinaptica può essere successivamente isolato per la sua insolubilità detersivo. Le tecniche utilizzate per isolare le membrane plasmatiche sinaptiche e proteine densità post-sinaptica rimane essenzialmente la stessa dopo 40 anni, e sono ampiamente utilizzati nella ricerca neuroscientifica attuale. Questo articolo descrive il frazionamento delle proteine associate alla membrana plasmatica sinaptica e la densità post-sinaptica utilizzando un gradiente di saccarosio discontinuo. Risultanti preparati proteici sono adatti per western blotting o l'analisi 2D DIGE.
Introduction
I neuroni comunicano attraverso le sinapsi, e la qualità di questa comunicazione è regolata in gran parte da alterazioni nella composizione delle proteine alla sinapsi. In particolare, le proteine ubicata nella densità postsinaptica partecipa nella comunicazione neuronale recettori dei neurotrasmettitori intimamente ponteggi con i loro sistemi di trasduzione del segnale 1. Inoltre, durevoli cambiamenti nella forza di efficacia sinaptica sono controllate mediante l'aggiunta o la rimozione di recettori alla densità post-sinaptica 1-6. Pertanto, l'isolamento e la quantificazione delle proteine sinaptiche è una tecnica necessaria ed utile al fine di conoscere i modi in cui i neuroni rispondono a stimoli e alterare l'efficacia sinaptica 7. Questo articolo descrive una tecnica comune per isolare le proteine sinaptiche da tessuto cerebrale dei roditori da ultracentrifugazione su gradiente discontinuo di saccarosio. La frazione di membrana plasmatica sinaptica può essere arricchita e isolato basa susua densità di saccarosio, che è stato determinato empiricamente essere simile a 1,2 M saccarosio.
A seconda della domanda biologica, frazioni subcellulari possono essere separati da gradienti continui o discontinui di entrambi saccarosio o Percoll. Gradienti continui consentono la separazione di proteine in più frazioni; questo può essere particolarmente utile per dimostrare la co-localizzazione delle proteine all'interno di una data frazione 8. Tuttavia, la preparazione di gradienti continui è più laborioso e non è necessaria per molte applicazioni. Gradienti discontinui sono relativamente facili da preparare e possono essere usate per separare le proteine in poche frazioni, generalmente definiti. Gradienti discontinui che sono costituiti da tre strati di saccarosio degli crescente molarità sono stati ampiamente utilizzati per isolare le proteine associate alla membrana plasmatica sinaptica (SPM). Questa frazione membrana plasmatica sinaptica può essere ulteriormente elaborato per la fractio densità post-sinaptican (PSD) per trattamento detergente e l'isolamento della frazione detergente-insolubili.
Quando questo processo è stato descritto nel 1960 del 9,10, microscopia elettronica è stato utilizzato per dimostrare gli organelli e membrane che circa definiscono la membrana plasmatica sinaptica e frazioni di densità post-sinaptici 9-14. Questi studi hanno dimostrato l'inclusione delle membrane pre e post-sinaptici e vescicole sinaptiche nella frazione SPM; dopo il trattamento detergente principalmente l'elettrone-densi, densità post-sinaptica erano visibili. Nella procedura, uno shock ipotonico viene utilizzato per pizzicare fuori i processi sinaptici dal corpo cellulare 10. Questo passaggio sfrutta il fatto che i mitocondri sono più resistenti agli shock osmotico e rimangono intatte, e quindi sedimentare sul fondo del gradiente di saccarosio (Figura 1).
Usando la stessa tecnica di arricchimento, le frazioni SPM e PSD erano di prima biochimicamentedefinito mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide e sequenziamento dei principali componenti proteiche 15-17. Blot Successivamente occidentale è stato utilizzato per rilevare e quantificare i livelli di proteine sinaptiche e definire ulteriormente queste frazioni (Figura 2). Abbiamo utilizzato questa tecnica nei nostri laboratori di quantificare i cambiamenti nei livelli sinaptici del trasportatore della dopamina che si verificano quando il locus Slc6a3 viene duplicato nei topi 18. Abbiamo anche usato questa tecnica in recettori NMDA topi deficienti per scoprire riduzioni specifiche per sinapsi in proteine che fanno parte della DISC1 interattoma 19.
E 'evidente da analisi western blot che le frazioni SPM contengono proteine di membrana delle vescicole sinaptiche, marcatori degli endosomi, proteine mitocondriali, membrana associata enzimi sintetici e molecole di trasduzione del segnale, così come componenti integrali della densità post-sinaptica e membrane plasmatiche sinaptiche 20-23. Efrazioni PSD Ven possono avere contaminazione con abbondanti proteine mitocondriali e può essere necessario eseguire una seconda sedimentazione sfumatura o fasi di purificazione aggiuntivi per rimuoverli 13. Recentemente, spettrometria di massa quantitativa ha fornito un elenco di oltre 100 proteine nei soli densità post-sinaptica, così come un'indicazione della relativa abbondanza di questi componenti 24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono diversi passaggi della procedura che sono fondamentali per un esito positivo. Nel passaggio 3, è importante che un grado costante di omogeneizzazione è ottenuta per ogni campione. Quando omogeneizzando tessuto con l'omogeneizzatore a motore, una velocità costante viene utilizzata non solo per la rotazione del pestello, ma anche con il numero di colpi. Il tempo di incubazione durante lo shock osmotico deve essere preciso, dal momento omogeneizzazione estesa o incubazione nella soluzione ipotonica si lisare…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).
Materials
| 1M HEPES, pH 7.4 | BioShop | HEP003.100 | |
| HEPES | BioShop | HEP001.500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507.1 | |
| EDTA | BioBasic | EB0185 | |
| PMSF | BioShop | PMS123.5 | |
| Aprotinin | BioShop | APR600.1 | |
| Leupeptin | BioShop | LEU001.1 | |
| Pepstatin | BioShop | PEP605.5 | |
| Benzamidine | BioShop | BEN601.25 | |
| Sodium fluoride | BioShop | SFL001.100 | |
| Sodium pyrophosphate | BioShop | SPP310.100 | |
| Sodium orthovanadate | BioShop | SOV664.10 | |
| β-glycerophosphate | BioShop | GYP001.10 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX506.500 | |
| 18G x 1 ½” needle | BD | 305196 | |
| 1cc syringe | BD | 309659 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog number | |
| Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23 | VWR | KT885450-0023 | |
| IKA Model RW 16 Basic Stirrer | IKA Works | 2572100 | |
| Sorvall SM-24 Fixed Angle Rotor | ThermoScientific | 29017 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | ThermoScientific | 46910 | |
| Thinwall Polyallomer Tubes (13.2mL) | Beckman Coulter | 331372 | |
| SW 41 Ti Rotor Swinging Bucket | Beckman Coulter | 331362 | |
| Beckman L-80 Floor Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Thickwall Polycarbonate Tubes (3.5mL) | Beckman Coulter | 349622 | |
| TLA-100.3 Fixed Angle Rotor | Beckman Coulter | 349481 | |
| Beckman TL-100 Tabletop Ultracentrifuge | Beckman Coulter |
References
- Delint-Ramirez, I., et al. In vivo composition of NMDA receptor signaling complexes differs between membrane subdomains and is modulated by PSD-95 and PSD-93. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 8162-8170 (2010).
- Wang, Q., et al. The psychiatric disease risk factors DISC1 and TNIK interact to regulate synapse composition and function. Mol Psychiatry. 16, (2010).
- Ehlers, M. D. Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting. Neuron. 28, 511-525 (2000).
- Tomita, S., Fukata, M., Nicoll, R. A., Bredt, D. S. Dynamic interaction of stargazin-like TARPs with cycling AMPA receptors at synapses. Science. 303, 1508-1511 (2004).
- Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54, 447-460 (2007).
- Bats, C., Groc, L., Choquet, D. The interaction between Stargazin and PSD-95 regulates AMPA receptor surface trafficking. Neuron. 53, 719-734 (2007).
- Ehlers, M. D. Activity level controls postsynaptic composition and signaling via the ubiquitin-proteasome system. Nat Neurosci. 6, 231-242 (2003).
- Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
- Rodriguez de Lores, A., Alberici, M., De Robertis, E. Ultrastructural and enzymic studies of cholinergic and non-cholinergic synaptic membranes isolated from brain cortex. Journal of Neurochemistry. 14, 215-225 (1967).
- Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J Anat. 96, 79-88 (1962).
- Cotman, C. W., Taylor, D. Isolation and structural studies on synaptic complexes from rat brain. J Cell Biol. 55, 696-711 (1972).
- Cotman, C. W., Banker, G., Churchill, L., Taylor, D. Isolation of postsynaptic densities from rat brain. The Journal of Cell Biology. 63, 441-455 (1974).
- Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities. The Journal of Cell Biology. 86, 831-845 (1980).
- Jones, D. H., Matus, A. I. Isolation of synaptic plasma membrane from brain by combined flotation-sedimentation density gradient centrifugation. Biochim Biophys Acta. 356, 276-287 (1974).
- Kennedy, M. B., Bennett, M. K., Erondu, N. E. Biochemical and immunochemical evidence that the “major postsynaptic density protein” is a subunit of a calmodulin-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80, 7357-7361 (1983).
- Moon, I. S., Apperson, M. L., Kennedy, M. B. The major tyrosine-phosphorylated protein in the postsynaptic density fraction is N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 3954-3958 (1994).
- Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4405-4410 (2008).
- Ma, D. K., et al. Neuronal activity-induced Gadd45b promotes epigenetic DNA demethylation and adult neurogenesis. Science. 323, 1074-1077 (2009).
- Budreck, E. C., Scheiffele, P. Neuroligin-3 is a neuronal adhesion protein at GABAergic and glutamatergic synapses. The European Journal of Neuroscience. 26, 1738-1748 (2007).
- Wu, J., et al. Arc/Arg3.1 regulates an endosomal pathway essential for activity-dependent beta-amyloid generation. Cell. 147, 615-628 (2011).
- Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation. J Cell Biol. 96, 1374-1388 (1983).
- Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity. Brain Res. 109, 285-309 (1976).
- Cheng, D., et al. Relative and absolute quantification of postsynaptic density proteome isolated from rat forebrain and cerebellum. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 5, 1158-1170 (2006).
- Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning : a Laboratory Manual. , (1989).
- Eggena, M., et al. Identification of histone H1 as a cognate antigen of the ulcerative colitis-associated marker antibody pANCA. J Autoimmun. 14, 83-97 (2000).
- Salahpour, A., et al. Homodimerization of the beta2-adrenergic receptor as a prerequisite for cell surface targeting. J Biol Chem. 279, 33390-33397 (2004).
- Bernocco, S., et al. Sequential detergent fractionation of primary neurons for proteomics studies. Proteomics. 8, 930-938 (2008).
- Grunewald, T. G., et al. Nuclear localization and cytosolic overexpression of LASP-1 correlates with tumor size and nodal-positivity of human breast carcinoma. BMC Cancer. 7, 198 (2007).
- Heimann, K., Percival, J. M., Weinberger, R., Gunning, P., Stow, J. L. Specific isoforms of actin-binding proteins on distinct populations of Golgi-derived vesicles. J Biol Chem. 274, 10743-10750 (1999).
- Neff, R. A., Gomez-Varela, D., Fernandes, C. C., Berg, D. K. Postsynaptic scaffolds for nicotinic receptors on neurons. Acta Pharmacol Sin. 30, 694-701 (2009).
- Cella, N., Cornejo-Uribe, R. R., Montes, G. S., Hynes, N. E., Chammas, R. The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novel differentiation marker for HC11 mouse mammary epithelial cells. Differentiation. 61, 113-120 (1996).
- Otera, H., et al. Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import. Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).
- Goubaeva, F., et al. Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).
- Lamers, K. J., et al. Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients. Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).
- Arunachalam, L., et al. Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells. Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).
- Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina. Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).
