不連続ショ糖勾配を用いてシナプス形質膜とシナプス後肥厚タンパク質の調製
Summary
この記事では、不連続スクロース勾配超遠心分離によってシナプス形質膜に関連するタンパク質の濃縮を詳しく説明します。シナプス後肥厚タンパク質のその後の調製も記載されている。タンパク質調製物は、ウェスタンブロットまたは2D DIGE分析に適している。
Abstract
神経細胞下分画技術がシナプスとの間で売買されているタンパク質の定量化を可能にします。もともと1960年代後半に記載されるように、シナプス形質膜に関連するタンパク質は、ショ糖密度勾配超遠心分離によって単離することができる。シナプス膜が単離されると、シナプス後密度として知られている高分子複合体は、続いて、その界面活性剤不溶性に単離することができる。シナプス形質膜およびシナプス後密度タンパク質を単離するために使用される技術は、40年後に本質的に同じままであり、広く現在の神経科学の研究で使用されている。この記事では、不連続ショ糖勾配を用いてシナプス形質膜とシナプス後密度に関連するタンパク質の分画について詳しく説明します。得られたタンパク質調製物は、ウェスタンブロットまたは2D DIGE分析に適している。
Introduction
ニューロンは、シナプスを介して通信しており、この通信の品質はシナプスにおけるタンパク質の組成変化によって大幅に規制されている。特に、シナプス後密度で存在するタンパク質は、そのシグナル伝達系1と密接に足場神経伝達物質受容体による神経細胞のコミュニケーションに参加しています。さらに、シナプス効力の強度の持続的な変化は、シナプス後密度1-6で追加または受容体を除去することによって制御されている。したがって、シナプスタンパク質の単離および定量化は、神経細胞がシナプス効力7を刺激し、変更するための対応方法への洞察を得るために必要かつ有用な技術である。この記事では、不連続ショ糖勾配超遠心分離によって齧歯類脳組織からシナプスのタンパク質を分離するために一般的な手法について説明します。シナプス形質膜画分を濃縮することができるとに基づいて単離さ経験的に1.2Mのショ糖に類似すると判断されたショ糖でのその密度、。
生物学的問題によっては、細胞下画分は、スクロース又はパーコールのいずれかの連続または不連続勾配によって分離することができる。連続勾配は、複数の画分へのタンパク質の分離を可能に。これは、与えられた画分8内のタンパク質の共局在を実証するために特に有用であり得る。しかし、連続的な勾配の調製は、より面倒であり、多くの用途のためには不要である。不連続勾配は調製が比較的容易であり、少数の、一般的に定義された画分にタンパク質を分離するために使用することができます。増加モル濃度の三スクロースの層から構成されている不連続勾配が広くシナプス形質膜（SPM）に関連するタンパク質を単離するために使用されてきた。このシナプス形質膜画分は、さらに、シナプス後密度fractioに加工することができる界面活性剤不溶性画分の界面活性剤処理および分離によりn（PSD）。
このプロセスは、最初に1960年代9,10に記載されたときに、電子顕微鏡は、大まかに、シナプス形質膜およびシナプス後密度画分9-14を定義細胞小器官、膜を実証した。これらの研究は、シナプス前および後膜とSPM画分中のシナプス小胞を含めることを実証した。界面活性剤処理した後、主に電子密度の高い、シナプス後密度が見えた。手順では、低張性ショックは、電池本体10からシナプスプロセスをピンチオフするために使用される。このステップは、ミトコンドリア浸透圧ショックに対してより耐性であり、無傷のままであり、従ってそれらはショ糖勾配（ 図1）の底部に沈降するという事実を利用する。
これと同じ濃縮技術を使用して、SPMとPSD画分を生化学的に最初でした主要なタンパク質成分15〜17のポリアクリルアミドゲル電気泳動および配列決定によって定義される。続いてウェスタンブロット分析（ 図2）、これらの画分を定義し、さらに検出し、シナプスのタンパク質のレベルを定量化するために使用されている。私たちは、SLC6A3遺伝子座をマウス18で重複しているときに発生するドーパミントランスポーターのシナプスレベルの変化を定量化するために私たちの研究室でこの技術を使用している。また、DISC1のインタラクトーム19の一部であるタンパク質中のシナプス特異的な減少を明らかにNMDA受容体欠損マウスでは、この技術を使用している。
これは、SPM画分を、シナプス小胞膜タンパク質、エンドソームのマーカー、ミトコンドリアタンパク質、膜結合合成酵素およびシグナル伝達分子、ならびにシナプス後密度の不可欠な構成要素とシナプス形質膜20〜23を含有し、ウェスタンブロット分析から明らかである。 EVEN PSD画分を豊富ミトコンドリアタンパク質の混入を持つことができ、それは彼ら13を除去する第二の勾配沈降または追加の精製工程を実行する必要があるかもしれない。最近では、定量的な質量分析だけでは、シナプス後密度の100以上のタンパク質のリスト、ならびにこれらの構成要素24,25の相対存在量の指標を提供してきました。
Protocol
Representative Results
Discussion
成功した結果のために重要である手順にはいくつかのステップがあります。ステップ3では、均質化の一貫性の程度は、各サンプルについて達成されることが重要である。モーター駆動ホモジナイザーで組織を均質化する場合には、一定の速度を乳棒の回転のためだけでなく、ストローク数でも利用される。低張液の拡張均質化またはインキュベーションがミトコンドリアを溶解し、SPMサンプ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).
Materials
| 1M HEPES, pH 7.4 | BioShop | HEP003.100 | |
| HEPES | BioShop | HEP001.500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507.1 | |
| EDTA | BioBasic | EB0185 | |
| PMSF | BioShop | PMS123.5 | |
| Aprotinin | BioShop | APR600.1 | |
| Leupeptin | BioShop | LEU001.1 | |
| Pepstatin | BioShop | PEP605.5 | |
| Benzamidine | BioShop | BEN601.25 | |
| Sodium fluoride | BioShop | SFL001.100 | |
| Sodium pyrophosphate | BioShop | SPP310.100 | |
| Sodium orthovanadate | BioShop | SOV664.10 | |
| β-glycerophosphate | BioShop | GYP001.10 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX506.500 | |
| 18G x 1 ½” needle | BD | 305196 | |
| 1cc syringe | BD | 309659 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog number | |
| Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23 | VWR | KT885450-0023 | |
| IKA Model RW 16 Basic Stirrer | IKA Works | 2572100 | |
| Sorvall SM-24 Fixed Angle Rotor | ThermoScientific | 29017 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | ThermoScientific | 46910 | |
| Thinwall Polyallomer Tubes (13.2mL) | Beckman Coulter | 331372 | |
| SW 41 Ti Rotor Swinging Bucket | Beckman Coulter | 331362 | |
| Beckman L-80 Floor Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Thickwall Polycarbonate Tubes (3.5mL) | Beckman Coulter | 349622 | |
| TLA-100.3 Fixed Angle Rotor | Beckman Coulter | 349481 | |
| Beckman TL-100 Tabletop Ultracentrifuge | Beckman Coulter |
References
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