Utarbeidelse av Synaptic Plasma Membran og postsynaptiske Density Proteiner Ved hjelp av en Discontinuous sukrosegradient

Summary

Denne artikkelen beskriver anrikning av proteiner forbundet med den synaptiske plasmamembranen ved ultrasentrifugering på en diskontinuerlig sukrosegradient. Den etterfølgende fremstilling av post-synaptiske tetthet proteiner er også beskrevet. Proteinpreparater er egnet for western blotting eller 2D DIGE analyse.

Abstract

Neuronal subcellulære fraksjoneringsteknikker tillater kvantifisering av proteiner som er trafikkert til og fra synapse. Som opprinnelig ble beskrevet i slutten av 1960-tallet, kan proteiner forbundet med den synaptiske plasmamembranen bli isolert ved ultrasentrifugering i en sukrose-densitets-gradient. Når synaptiske membraner er isolert, kan det makromolekylære kompleks kjent som post-synaptiske densitet deretter isolert på grunn av sin uoppløselighet vaskemiddel. Teknikkene som brukes til å isolere synaptiske plasmamembraner og post-synaptiske tetthet proteiner forblir i hovedsak de samme etter 40 år, og er mye brukt i dagens nevrovitenskap forskning. Denne artikkelen beskriver fraksjonering av proteiner forbundet med den synaptiske plasmamembranen og post-synaptiske tetthet ved hjelp av en diskontinuerlig sukrosegradient. Resulterende proteinpreparater er egnet for western blotting eller 2D DIGE analyse.

Introduction

Neuroner kommuniserer gjennom synapser, og kvaliteten av denne kommunikasjonen er regulert i stor grad ved endringer i sammensetningen av proteiner i synapsen. Spesielt proteiner som ligger i den postsynaptiske tetthet delta i neuronal kommunikasjon ved intimt stillasnevrotransmitterreseptorer med sine signaltransduksjonsveiene systemer ^en. Videre er varige endringer i styrken av synaptisk effektivitet kontrollert ved tilsetning eller fjerning av reseptorer på postsynaptiske tetthet ^1-6. Derfor er isolering og kvantifisering av synaptiske proteiner en nødvendig og nyttig teknikk for å få innsikt i de måter som nevronene reagerer på stimuli og endre synaptiske effekt ^7. Denne artikkelen beskriver en vanlig teknikk for å isolere synaptiske proteiner fra gnagere hjernevev etter ultracentrifugation på diskontinuerlige sakkarosegradienter. Den synaptiske plasmamembran brøkdel kan bli beriket og isolert basert pådens tetthet på sukrose, som er empirisk bestemt til å være lik 1,2 M sukrose.

Avhengig av den biologiske spørsmålet kan subcellulære fraksjoner separeres ved kontinuerlige eller diskontinuerlige gradienter av enten sukrose eller Percoll. Kontinuerlige gradienter tillate separasjon av proteiner i flere fraksjoner; Dette kan være spesielt nyttig for å demonstrere den ko-lokalisering av proteinene i løpet av en gitt fraksjon ^8. Imidlertid er fremstillingen av kontinuerlige graderinger mer arbeidskrevende og er ikke nødvendig for mange anvendelser. Diskontinuerlige gradienter er forholdsvis lettere å forberede og kan brukes til å separere proteiner i et par, generelt definerte fraksjoner. Diskontinuerlige gradienter som er sammensatt av tre lag av sucrose øker molaritet har blitt mye brukt for å isolere proteiner forbundet med den synaptiske plasmamembranen (SPM). Dette synaptiske plasmamembran brøkdel kan behandles videre til den postsynaptiske tetthet fraction (PSD) av vaskemiddelbehandling og isolering av vaskemiddel-uløselige fraksjonen.

Når denne prosessen ble først beskrevet i 1960 ^9,10, ble elektronmikroskopi brukes til å demonstrere de organeller og membraner som grovt definerer den synaptiske plasmamembranen og post-synaptiske tetthet fraksjoner ^9-14. Disse studiene viste inkludering av pre-og post-synaptiske membraner og synaptiske vesikler i SPM fraksjon; etter at vaskemiddelbehandling primært elektrontette, post-synaptiske tettheter var synlig. I fremgangsmåten, blir en hypotonisk sjokk som brukes til å klemme ut de synaptiske prosesser fra cellelegemet ^10. Dette trinnet tar fordel av det faktum at mitokondriene er mer motstandsdyktig overfor osmotisk sjokk og forbli intakt, og slik at de sedimentere på bunnen av sukrose gradient (figur 1).

Ved hjelp av denne samme berikelse teknikk, var de SPM og PSD fraksjoner første biokjemiskdefinert ved polyakrylamidgel-elektroforese, og sekvensering av de store protein-komponenter ^15-17. Deretter western blot-analyse ble brukt for å påvise og kvantifisere nivåene av synaptiske proteiner, og videre definere disse fraksjoner (figur 2). Vi har brukt denne teknikken i våre laboratorier for å kvantifisere endringer i de synaptiske nivåer av dopamin transporter som oppstår når Slc6a3 locus er duplisert i mus ^18. Vi har også brukt denne teknikken i NMDA reseptor mangelfull mus å avdekke synapse spesifikke reduksjoner i proteiner som er en del av DISC1 interactome ^19.

Det er tydelig fra western blot analyse at SPM fraksjoner inneholder synaptiske vesikkel membranproteiner, endosome markører, mitokondrie protein, membran assosiert syntetiske enzymer og signaltransduksjon molekyler, så vel som integrerte komponenter av den postsynaptiske tetthet og synaptiske plasmamembraner ^20-23. Even PSD fraksjoner kan ha forurensning med rikelig mitokondrie protein, og det kan være nødvendig å utføre en andre gradient sedimentasjon eller flere rensetrinn for å fjerne dem ^13. Nylig er kvantitative massespektrometri ga en liste over 100 proteinene i den postsynaptiske densitet alene, så vel som en indikasjon på den relative overflod av disse komponentene ^24,25.

Protocol

Følgende protokoll er i samsvar med retningslinjene i den kanadiske Council of Animal Care og er godkjent av Det medisinske fakultet og Pharmacy Animal Care Utvalget ved Universitetet i Toronto. 1. Utarbeide nødvendig reagenser som beskrevet i Tabell 1. Legg protease og fosfatase (om nødvendig) inhibitorer for alle løsningene sukrose, buffere og DDH 2 O i konsentrasjoner som er skissert i Tabell 1. Viktig utføre alle trinnene ved 4 ° C og pre-kul …

Representative Results

Fremstillingen av sukrose tetthetsgradient bør resultere i en klar separering av de tre molare oppløsninger av sukrose (0,8, 1,0, og 1,2 M sukrose). Se figur 3A for et eksempel på gradienten før proteinprøve ble tilsatt. Hvis gradienten er forberedt for mye på forhånd, eller om det er forberedt på en benk overflate med vibrasjoner fra annet utstyr, vil gradient bli kompromittert og riktig separasjon vil ikke oppnås. Hvis et klart skille mellom de tre løsningene ikke er synlig, er det tilrådel…

Discussion

Det er flere trinn i prosedyren som er kritiske for et vellykket resultat. I trinn 3, er det viktig at en ensartet grad av homogenisering er oppnådd for hver prøve. Når homogenisere vevet med motordrevet homogenisator, blir en konstant hastighet brukes ikke bare for rotasjon av stampe, men også med det antall slag. Inkubasjonstiden løpet av osmotisk sjokk bør være nøyaktig, siden utvidet homogenisering eller inkubering i hypoton løsning vil lyserer mitokondrier og forurense SPM prøven.

<p class="jove_conte…

Materials

1M HEPES, pH 7.4	BioShop	HEP003.100
HEPES	BioShop	HEP001.500
Sucrose	BioShop	SUC507.1
EDTA	BioBasic	EB0185
PMSF	BioShop	PMS123.5
Aprotinin	BioShop	APR600.1
Leupeptin	BioShop	LEU001.1
Pepstatin	BioShop	PEP605.5
Benzamidine	BioShop	BEN601.25
Sodium fluoride	BioShop	SFL001.100
Sodium pyrophosphate	BioShop	SPP310.100
Sodium orthovanadate	BioShop	SOV664.10
β-glycerophosphate	BioShop	GYP001.10
Triton X-100	BioShop	TRX506.500
18G x 1 ½” needle	BD	305196
1cc syringe	BD	309659
Name of Equipment	Company	Catalog number
Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23	VWR	KT885450-0023
IKA Model RW 16 Basic Stirrer	IKA Works	2572100
Sorvall SM-24 Fixed Angle Rotor	ThermoScientific	29017
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	ThermoScientific	46910
Thinwall Polyallomer Tubes (13.2mL)	Beckman Coulter	331372
SW 41 Ti Rotor Swinging Bucket	Beckman Coulter	331362
Beckman L-80 Floor Ultracentrifuge	Beckman Coulter
Thickwall Polycarbonate Tubes (3.5mL)	Beckman Coulter	349622
TLA-100.3 Fixed Angle Rotor	Beckman Coulter	349481
Beckman TL-100 Tabletop Ultracentrifuge	Beckman Coulter