Подготовка Synaptic плазматической мембраны и Постсинаптических белков плотности с использованием разрывной градиента сахарозы
Summary
В данной статье подробно обогащение белков, ассоциированных с плазматической мембраны синаптической с помощью ультрацентрифугирования на разрывной градиенте сахарозы. Последующая подготовка постсинаптических белков плотности также описывается. Белковые препараты подходят для вестерн-блоттинга или анализа 2D ПГЛП.
Abstract
Нейронные субклеточные методы фракционирования позволит количественно оценить белков, которые продают в и из синапса. Как первоначально описано в конце 1960-х, белки, ассоциированные с плазматической мембраны синаптической может быть выделен с помощью ультрацентрифугирования на градиенте плотности сахарозы. После того, как синаптических мембран изолированы, макромолекулярный комплекс известен как постсинаптической плотности может быть затем выделяют в связи с его нерастворимости моющего средства. Методы, используемые для изоляции синаптических мембран в плазме и пост-синаптические белки плотности остаются практически то же самое после 40 лет, и широко используются в современных исследованиях в области нейронаук. Эта статья подробно описывает фракционирование белков, связанных с синаптической мембраны плазмы и постсинаптического плотность с помощью прерывистой градиенте сахарозы. Полученные белковые препараты подходят для вестерн-блоттинга или анализа 2D ПГЛП.
Introduction
Нейроны взаимодействуют через синапсов, и качество этой связи регулируется в значительной степени от изменений в составе белков в синапсах. В частности, белки, расположенные в постсинаптической плотности участие в нейронной связи путем тщательного лесов рецепторов нейромедиаторов с их системами передачи сигнала 1. Кроме того, длительные изменения в силе синаптической контролируются добавления или удаления рецепторов на постсинаптической плотности 1-6. Таким образом, изоляция и количественная оценка синаптических белков является необходимым и полезным методом, чтобы разобраться в путях, что нейроны реагируют на стимулы и изменять синаптическую эффективность 7. В этой статье описывается общий метод, чтобы изолировать синаптические белки из грызунов мозговой ткани ультрацентрифугированием на разрывных градиентах сахарозы. Синаптической плазмы мембранную фракцию можно обогатить и изолированных основеего плотность в сахарозе, которые были определены эмпирически, чтобы быть похожими на 1,2 М сахарозы.
В зависимости от биологической вопрос, субклеточные фракции могут быть разделены с помощью непрерывных или прерывистых градиентах сахарозы или любой перколлом. Непрерывные градиенты позволяют для разделения белков в нескольких фракций; это может быть особенно полезно, чтобы продемонстрировать совместную локализацию протеинов в пределах данного фракции 8. Тем не менее, получение непрерывных градиентов более трудоемким и не является необходимым для многих приложений. Разрывные градиенты сравнительно легче подготовить и может быть использован для разделения белков в несколько, как правило, определенных фракций. Разрывные градиенты, которые состоят из трех сахарозы слоев увеличением молярностью были широко использованы для выделения белков, связанных с синаптической мембране плазмы (СЗМ). Это синаптической плазмы мембранную фракцию может быть дополнительно обработан в постсинаптической плотности fractioN (PSD) путем обработки моющим средством и изоляции моющего средства нерастворимые фракции.
Когда этот процесс был впервые описан в 1960-х годах 9,10, электронную микроскопию использовали для демонстрации органеллы и мембраны, что примерно определяют синаптическую мембрану плазмы и пост-синаптические плотности фракции 9-14. Эти исследования показали, включение до и после синаптических мембран и синаптических пузырьков в СЗМ фракции; после моющего средства лечения, прежде всего, электронно-плотного, пост-синаптические плотности были видны. В процедуре, гипотоническая шок используется отщипнуть синаптические процессы от тела клетки 10. Этот шаг использует тот факт, что митохондрии являются более устойчивыми к осмотического шока и остался нетронутым, и поэтому они оседают на дне градиенте сахарозы (Рисунок 1).
Используя эту же технику по обогащению, СЗМ и PSD фракции были первые биохимическиопределяется с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и последовательности основных белковых компонентов 15-17. Затем вестерн-блот анализ был использован для обнаружения и количественной оценки уровней синаптических белков и дальнейшего определения этих фракций (рисунок 2). Мы использовали эту технику в наших лабораториях для количественного изменения в синаптических уровней переносчика дофамина, которые происходят, когда локус Slc6a3 дублируется на мышах 18. Мы также использовали эту технику в рецепторных NMDA дефицитных мышей, чтобы раскрыть синапсов конкретных сокращений белков, которые являются частью DISC1 интерактома 19.
Как видно из Вестерн-блоттинга, что СЗМ фракции содержат синаптические везикулы мембранные белки, эндосоме маркеры, митохондриальные белки, мембранные связано синтетические ферменты и молекулы передачи сигнала, а также с составными элементами пост-синаптической плотности и синаптические плазменные мембраны 20-23. EVEN PSD фракции может иметь загрязнения с обильным митохондриальных белков и это может быть необходимо для выполнения второго градиента седиментации или дополнительных стадий очистки, чтобы удалить их 13. В последнее время количественный масс-спектрометрии предоставила список из более чем 100 белков в одиночку постсинаптической плотности, а также указание на относительное обилие этих компонентов 24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Есть несколько шагов, в порядке, которые важны для успешного исхода. В шаге 3, важно, чтобы соответствовать степени гомогенизации достигается для каждого образца. При гомогенизации ткани с приводом от двигателя гомогенизатор, константа скорости используется не только для вращения пест…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).
Materials
| 1M HEPES, pH 7.4 | BioShop | HEP003.100 | |
| HEPES | BioShop | HEP001.500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507.1 | |
| EDTA | BioBasic | EB0185 | |
| PMSF | BioShop | PMS123.5 | |
| Aprotinin | BioShop | APR600.1 | |
| Leupeptin | BioShop | LEU001.1 | |
| Pepstatin | BioShop | PEP605.5 | |
| Benzamidine | BioShop | BEN601.25 | |
| Sodium fluoride | BioShop | SFL001.100 | |
| Sodium pyrophosphate | BioShop | SPP310.100 | |
| Sodium orthovanadate | BioShop | SOV664.10 | |
| β-glycerophosphate | BioShop | GYP001.10 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX506.500 | |
| 18G x 1 ½” needle | BD | 305196 | |
| 1cc syringe | BD | 309659 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog number | |
| Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23 | VWR | KT885450-0023 | |
| IKA Model RW 16 Basic Stirrer | IKA Works | 2572100 | |
| Sorvall SM-24 Fixed Angle Rotor | ThermoScientific | 29017 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | ThermoScientific | 46910 | |
| Thinwall Polyallomer Tubes (13.2mL) | Beckman Coulter | 331372 | |
| SW 41 Ti Rotor Swinging Bucket | Beckman Coulter | 331362 | |
| Beckman L-80 Floor Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Thickwall Polycarbonate Tubes (3.5mL) | Beckman Coulter | 349622 | |
| TLA-100.3 Fixed Angle Rotor | Beckman Coulter | 349481 | |
| Beckman TL-100 Tabletop Ultracentrifuge | Beckman Coulter |
References
- Delint-Ramirez, I., et al. In vivo composition of NMDA receptor signaling complexes differs between membrane subdomains and is modulated by PSD-95 and PSD-93. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 8162-8170 (2010).
- Wang, Q., et al. The psychiatric disease risk factors DISC1 and TNIK interact to regulate synapse composition and function. Mol Psychiatry. 16, (2010).
- Ehlers, M. D. Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting. Neuron. 28, 511-525 (2000).
- Tomita, S., Fukata, M., Nicoll, R. A., Bredt, D. S. Dynamic interaction of stargazin-like TARPs with cycling AMPA receptors at synapses. Science. 303, 1508-1511 (2004).
- Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54, 447-460 (2007).
- Bats, C., Groc, L., Choquet, D. The interaction between Stargazin and PSD-95 regulates AMPA receptor surface trafficking. Neuron. 53, 719-734 (2007).
- Ehlers, M. D. Activity level controls postsynaptic composition and signaling via the ubiquitin-proteasome system. Nat Neurosci. 6, 231-242 (2003).
- Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
- Rodriguez de Lores, A., Alberici, M., De Robertis, E. Ultrastructural and enzymic studies of cholinergic and non-cholinergic synaptic membranes isolated from brain cortex. Journal of Neurochemistry. 14, 215-225 (1967).
- Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J Anat. 96, 79-88 (1962).
- Cotman, C. W., Taylor, D. Isolation and structural studies on synaptic complexes from rat brain. J Cell Biol. 55, 696-711 (1972).
- Cotman, C. W., Banker, G., Churchill, L., Taylor, D. Isolation of postsynaptic densities from rat brain. The Journal of Cell Biology. 63, 441-455 (1974).
- Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities. The Journal of Cell Biology. 86, 831-845 (1980).
- Jones, D. H., Matus, A. I. Isolation of synaptic plasma membrane from brain by combined flotation-sedimentation density gradient centrifugation. Biochim Biophys Acta. 356, 276-287 (1974).
- Kennedy, M. B., Bennett, M. K., Erondu, N. E. Biochemical and immunochemical evidence that the “major postsynaptic density protein” is a subunit of a calmodulin-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80, 7357-7361 (1983).
- Moon, I. S., Apperson, M. L., Kennedy, M. B. The major tyrosine-phosphorylated protein in the postsynaptic density fraction is N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 3954-3958 (1994).
- Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4405-4410 (2008).
- Ma, D. K., et al. Neuronal activity-induced Gadd45b promotes epigenetic DNA demethylation and adult neurogenesis. Science. 323, 1074-1077 (2009).
- Budreck, E. C., Scheiffele, P. Neuroligin-3 is a neuronal adhesion protein at GABAergic and glutamatergic synapses. The European Journal of Neuroscience. 26, 1738-1748 (2007).
- Wu, J., et al. Arc/Arg3.1 regulates an endosomal pathway essential for activity-dependent beta-amyloid generation. Cell. 147, 615-628 (2011).
- Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation. J Cell Biol. 96, 1374-1388 (1983).
- Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity. Brain Res. 109, 285-309 (1976).
- Cheng, D., et al. Relative and absolute quantification of postsynaptic density proteome isolated from rat forebrain and cerebellum. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 5, 1158-1170 (2006).
- Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning : a Laboratory Manual. , (1989).
- Eggena, M., et al. Identification of histone H1 as a cognate antigen of the ulcerative colitis-associated marker antibody pANCA. J Autoimmun. 14, 83-97 (2000).
- Salahpour, A., et al. Homodimerization of the beta2-adrenergic receptor as a prerequisite for cell surface targeting. J Biol Chem. 279, 33390-33397 (2004).
- Bernocco, S., et al. Sequential detergent fractionation of primary neurons for proteomics studies. Proteomics. 8, 930-938 (2008).
- Grunewald, T. G., et al. Nuclear localization and cytosolic overexpression of LASP-1 correlates with tumor size and nodal-positivity of human breast carcinoma. BMC Cancer. 7, 198 (2007).
- Heimann, K., Percival, J. M., Weinberger, R., Gunning, P., Stow, J. L. Specific isoforms of actin-binding proteins on distinct populations of Golgi-derived vesicles. J Biol Chem. 274, 10743-10750 (1999).
- Neff, R. A., Gomez-Varela, D., Fernandes, C. C., Berg, D. K. Postsynaptic scaffolds for nicotinic receptors on neurons. Acta Pharmacol Sin. 30, 694-701 (2009).
- Cella, N., Cornejo-Uribe, R. R., Montes, G. S., Hynes, N. E., Chammas, R. The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novel differentiation marker for HC11 mouse mammary epithelial cells. Differentiation. 61, 113-120 (1996).
- Otera, H., et al. Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import. Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).
- Goubaeva, F., et al. Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).
- Lamers, K. J., et al. Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients. Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).
- Arunachalam, L., et al. Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells. Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).
- Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina. Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).
