Beredning av Synaptic plasmamembranet och Postsynaptiska Density Proteiner hjälp av en kontinuerliga sukrosgradient
Summary
Den här artikeln detaljer anrikningen av proteinerna som är associerade med synaptiska plasmamembran genom ultracentrifugering på en diskontinuerlig sackarosgradient. Den efterföljande beredningen av postsynaptiska densitet proteiner beskrivs också. Protein preparat är lämpliga för western blotting eller 2D Dige analys.
Abstract
Neuronala subcellulära fraktioneringstekniker tillåter kvantifiering av proteiner som trafikerade till och från synapsen. Som ursprungligen beskrivits i det sena 1960-talet, kan proteiner som är associerade med synaptiska plasmamembran isoleras genom ultracentrifugering på en sackarosdensitetsgradient. När synaptiska membran är isolerade, kan den makromolekylära komplex kallas postsynaptiska densitet därefter isoleras på grund av dess tvättmedel olöslighet. De tekniker som används för att isolera synaptiska plasmamembran och postsynaptiska densitet proteiner är i princip desamma efter 40 år, och används ofta i aktuell neurovetenskaplig forskning. Den här artikeln detaljer fraktionering av proteiner som är associerade med synaptiska plasmamembranet och postsynaptiska densitet med hjälp av en diskontinuerlig sackarosgradient. Resulteproteinpreparat är lämpliga för western blotting eller 2D Dige analys.
Introduction
Nervceller kommunicerar genom synapser, och kvaliteten på detta meddelande regleras till stor del av förändringar i sammansättningen av proteiner i synapsen. Särskilt proteinerna ligger i den postsynaptiska densitet deltar i neuronal kommunikation genom intim byggnadsställningar neurotransmittorreceptorer med deras signalöverföringssystem 1. Dessutom är bestående förändringar i styrkan i synaptiska effekten regleras genom tillsats eller borttagande av receptorer på postsynaptiska densitet 1-6. Därför är isolering och kvantifiering av synaptiska proteiner en nödvändig och användbar teknik för att få insikt i de sätt som nervceller reagerar på stimuli och förändra synaptisk effekt 7. Den här artikeln beskriver en vanlig teknik för att isolera synaptiska proteiner från gnagare hjärnvävnad genom ultracentrifugering på diskontinuerliga sackarosgradienter. Den synaptiska plasmamembranfraktionen kan berikas och isolerade utifråndess densitet i sackaros, som har empiriskt bestämts att vara liknande 1,2 M sackaros.
Beroende på den biologiska frågan, kan subcellulära fraktioner separeras genom kontinuerliga eller diskontinuerliga gradienter av antingen sackaros eller Percoll. Kontinuerliga gradienter möjliggöra separation av proteiner i flera fraktioner; detta kan vara särskilt användbara för att påvisa sam-lokalisering av proteiner inom en given fraktion 8. Emellertid är framställningen av kontinuerliga gradienter mer arbetskrävande och är onödigt för många tillämpningar. Diskontinuerliga gradienter är jämförelsevis enklare att framställa och kan användas för att separera proteiner i ett fåtal, vanligen definierade fraktioner. Diskontinuerliga gradienter som är sammansatta av tre sackaros-skikt av ökande molaritet har ofta använts för att isolera proteiner som är associerade med synaptiska plasmamembran (SPM). Denna synaptiska plasmamembran fraktionen kan bearbetas vidare till den postsynaptiska densitet FRACTIOn (PSD) av detergent behandling och isolering av den detergent-olösliga fraktionen.
När denna process beskrevs först på 1960-talet 9,10, var elektronmikroskopi som används för att demonstrera organeller och membran som grovt definierar synaptiska plasmamembranet och post-synaptiska densitet fraktionerna 9-14. Dessa studier visade att inkludera pre-och postsynaptiska membran och synaptiska vesiklar i SPM fraktion; efter detergentbehandling främst elektron-täta, postsynaptiska tätheter var synliga. I förfarandet används en hypotonisk chock används för att nypa av de synaptiska processerna från cellkroppen 10. Detta steg tar fördel av det faktum att mitokondrierna är mer resistenta mot osmotisk chock och förbli intakt, och så att de sedimenterar vid botten av den sackaros gradient (figur 1).
Genom att använda samma anrikningsteknik, var SPM och PSD fraktioner först biokemisktdefinieras genom polyakrylamidgelelektrofores och sekvensering av de större proteinkomponenter 15-17. Därefter western blot-analys har använts för att detektera och kvantifiera halterna av synaptiska proteiner och ytterligare definiera dessa fraktioner (Figur 2). Vi har använt denna teknik i våra laboratorier för att kvantifiera förändringar i de synaptiska nivåerna av dopamintransportören som inträffar när Slc6a3 lokuset dupliceras i möss 18. Vi har också använt denna teknik i NMDA-receptorfattiga möss för att avslöja synaps specifika minskningar av proteiner som är en del av DISC1 interactome 19.
Det framgår av western blot-analys som SPM fraktioner innehåller synaptiska vesikler membranproteiner, endosom markörer, mitokondriella proteiner, membranassocierade syntetiska enzymer och signaltransduktionsmolekyler samt integrerade delar av den postsynaptiska densitet och synaptiska plasmamembran 20-23. ÖVen PSD fraktioner kan ha kontaminering med rikliga mitokondriella proteiner och det kan vara nödvändigt att utföra en andra gradient sedimentation eller ytterligare reningssteg för att avlägsna dem 13. Nyligen har kvantitativ masspektrometri lämnat en lista med över 100 proteiner i postsynaptiska densitet ensam, samt en indikation på den relativa förekomsten av dessa komponenter 24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns flera steg i förfarandet som är kritiska för ett framgångsrikt resultat. I steg 3 är det viktigt att en konsekvent grad av homogenisering uppnås för varje prov. Vid homogenisering vävnad med motordriven homogenisator, är en konstant hastighet används inte bara för rotation av mortelstöten, men också med antal slag. Inkubationstiden under osmotisk chock bör vara exakt, eftersom förlängd homogenisering eller inkubation i hypoton lösning kommer att lysera mitokondrier och förorena SPM provet. </…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).
Materials
| 1M HEPES, pH 7.4 | BioShop | HEP003.100 | |
| HEPES | BioShop | HEP001.500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507.1 | |
| EDTA | BioBasic | EB0185 | |
| PMSF | BioShop | PMS123.5 | |
| Aprotinin | BioShop | APR600.1 | |
| Leupeptin | BioShop | LEU001.1 | |
| Pepstatin | BioShop | PEP605.5 | |
| Benzamidine | BioShop | BEN601.25 | |
| Sodium fluoride | BioShop | SFL001.100 | |
| Sodium pyrophosphate | BioShop | SPP310.100 | |
| Sodium orthovanadate | BioShop | SOV664.10 | |
| β-glycerophosphate | BioShop | GYP001.10 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX506.500 | |
| 18G x 1 ½” needle | BD | 305196 | |
| 1cc syringe | BD | 309659 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog number | |
| Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23 | VWR | KT885450-0023 | |
| IKA Model RW 16 Basic Stirrer | IKA Works | 2572100 | |
| Sorvall SM-24 Fixed Angle Rotor | ThermoScientific | 29017 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | ThermoScientific | 46910 | |
| Thinwall Polyallomer Tubes (13.2mL) | Beckman Coulter | 331372 | |
| SW 41 Ti Rotor Swinging Bucket | Beckman Coulter | 331362 | |
| Beckman L-80 Floor Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Thickwall Polycarbonate Tubes (3.5mL) | Beckman Coulter | 349622 | |
| TLA-100.3 Fixed Angle Rotor | Beckman Coulter | 349481 | |
| Beckman TL-100 Tabletop Ultracentrifuge | Beckman Coulter |
References
- Delint-Ramirez, I., et al. In vivo composition of NMDA receptor signaling complexes differs between membrane subdomains and is modulated by PSD-95 and PSD-93. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 8162-8170 (2010).
- Wang, Q., et al. The psychiatric disease risk factors DISC1 and TNIK interact to regulate synapse composition and function. Mol Psychiatry. 16, (2010).
- Ehlers, M. D. Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting. Neuron. 28, 511-525 (2000).
- Tomita, S., Fukata, M., Nicoll, R. A., Bredt, D. S. Dynamic interaction of stargazin-like TARPs with cycling AMPA receptors at synapses. Science. 303, 1508-1511 (2004).
- Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54, 447-460 (2007).
- Bats, C., Groc, L., Choquet, D. The interaction between Stargazin and PSD-95 regulates AMPA receptor surface trafficking. Neuron. 53, 719-734 (2007).
- Ehlers, M. D. Activity level controls postsynaptic composition and signaling via the ubiquitin-proteasome system. Nat Neurosci. 6, 231-242 (2003).
- Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
- Rodriguez de Lores, A., Alberici, M., De Robertis, E. Ultrastructural and enzymic studies of cholinergic and non-cholinergic synaptic membranes isolated from brain cortex. Journal of Neurochemistry. 14, 215-225 (1967).
- Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J Anat. 96, 79-88 (1962).
- Cotman, C. W., Taylor, D. Isolation and structural studies on synaptic complexes from rat brain. J Cell Biol. 55, 696-711 (1972).
- Cotman, C. W., Banker, G., Churchill, L., Taylor, D. Isolation of postsynaptic densities from rat brain. The Journal of Cell Biology. 63, 441-455 (1974).
- Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities. The Journal of Cell Biology. 86, 831-845 (1980).
- Jones, D. H., Matus, A. I. Isolation of synaptic plasma membrane from brain by combined flotation-sedimentation density gradient centrifugation. Biochim Biophys Acta. 356, 276-287 (1974).
- Kennedy, M. B., Bennett, M. K., Erondu, N. E. Biochemical and immunochemical evidence that the “major postsynaptic density protein” is a subunit of a calmodulin-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80, 7357-7361 (1983).
- Moon, I. S., Apperson, M. L., Kennedy, M. B. The major tyrosine-phosphorylated protein in the postsynaptic density fraction is N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 3954-3958 (1994).
- Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4405-4410 (2008).
- Ma, D. K., et al. Neuronal activity-induced Gadd45b promotes epigenetic DNA demethylation and adult neurogenesis. Science. 323, 1074-1077 (2009).
- Budreck, E. C., Scheiffele, P. Neuroligin-3 is a neuronal adhesion protein at GABAergic and glutamatergic synapses. The European Journal of Neuroscience. 26, 1738-1748 (2007).
- Wu, J., et al. Arc/Arg3.1 regulates an endosomal pathway essential for activity-dependent beta-amyloid generation. Cell. 147, 615-628 (2011).
- Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation. J Cell Biol. 96, 1374-1388 (1983).
- Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity. Brain Res. 109, 285-309 (1976).
- Cheng, D., et al. Relative and absolute quantification of postsynaptic density proteome isolated from rat forebrain and cerebellum. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 5, 1158-1170 (2006).
- Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning : a Laboratory Manual. , (1989).
- Eggena, M., et al. Identification of histone H1 as a cognate antigen of the ulcerative colitis-associated marker antibody pANCA. J Autoimmun. 14, 83-97 (2000).
- Salahpour, A., et al. Homodimerization of the beta2-adrenergic receptor as a prerequisite for cell surface targeting. J Biol Chem. 279, 33390-33397 (2004).
- Bernocco, S., et al. Sequential detergent fractionation of primary neurons for proteomics studies. Proteomics. 8, 930-938 (2008).
- Grunewald, T. G., et al. Nuclear localization and cytosolic overexpression of LASP-1 correlates with tumor size and nodal-positivity of human breast carcinoma. BMC Cancer. 7, 198 (2007).
- Heimann, K., Percival, J. M., Weinberger, R., Gunning, P., Stow, J. L. Specific isoforms of actin-binding proteins on distinct populations of Golgi-derived vesicles. J Biol Chem. 274, 10743-10750 (1999).
- Neff, R. A., Gomez-Varela, D., Fernandes, C. C., Berg, D. K. Postsynaptic scaffolds for nicotinic receptors on neurons. Acta Pharmacol Sin. 30, 694-701 (2009).
- Cella, N., Cornejo-Uribe, R. R., Montes, G. S., Hynes, N. E., Chammas, R. The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novel differentiation marker for HC11 mouse mammary epithelial cells. Differentiation. 61, 113-120 (1996).
- Otera, H., et al. Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import. Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).
- Goubaeva, F., et al. Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).
- Lamers, K. J., et al. Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients. Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).
- Arunachalam, L., et al. Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells. Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).
- Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina. Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).
