Questo articolo descrive l'arricchimento di proteine associate con la membrana plasmatica sinaptica da ultracentrifugazione su gradiente di saccarosio discontinuo. La successiva preparazione di proteine di densità post-sinaptica è anche descritto. Preparati proteici sono adatti per western blotting o l'analisi 2D DIGE.
Neuronali tecniche di frazionamento subcellulare consentono la quantificazione di proteine che sono vittime della tratta da e per la sinapsi. Come originariamente descritto nel tardo 1960, proteine associate alla membrana plasmatica sinaptica possono essere isolati da ultracentrifugazione su gradiente di densità di saccarosio. Una volta membrane sinaptiche sono isolati, il complesso macromolecolare nota come la densità post-sinaptica può essere successivamente isolato per la sua insolubilità detersivo. Le tecniche utilizzate per isolare le membrane plasmatiche sinaptiche e proteine densità post-sinaptica rimane essenzialmente la stessa dopo 40 anni, e sono ampiamente utilizzati nella ricerca neuroscientifica attuale. Questo articolo descrive il frazionamento delle proteine associate alla membrana plasmatica sinaptica e la densità post-sinaptica utilizzando un gradiente di saccarosio discontinuo. Risultanti preparati proteici sono adatti per western blotting o l'analisi 2D DIGE.
I neuroni comunicano attraverso le sinapsi, e la qualità di questa comunicazione è regolata in gran parte da alterazioni nella composizione delle proteine alla sinapsi. In particolare, le proteine ubicata nella densità postsinaptica partecipa nella comunicazione neuronale recettori dei neurotrasmettitori intimamente ponteggi con i loro sistemi di trasduzione del segnale 1. Inoltre, durevoli cambiamenti nella forza di efficacia sinaptica sono controllate mediante l'aggiunta o la rimozione di recettori alla densità post-sinaptica 1-6. Pertanto, l'isolamento e la quantificazione delle proteine sinaptiche è una tecnica necessaria ed utile al fine di conoscere i modi in cui i neuroni rispondono a stimoli e alterare l'efficacia sinaptica 7. Questo articolo descrive una tecnica comune per isolare le proteine sinaptiche da tessuto cerebrale dei roditori da ultracentrifugazione su gradiente discontinuo di saccarosio. La frazione di membrana plasmatica sinaptica può essere arricchita e isolato basa susua densità di saccarosio, che è stato determinato empiricamente essere simile a 1,2 M saccarosio.
A seconda della domanda biologica, frazioni subcellulari possono essere separati da gradienti continui o discontinui di entrambi saccarosio o Percoll. Gradienti continui consentono la separazione di proteine in più frazioni; questo può essere particolarmente utile per dimostrare la co-localizzazione delle proteine all'interno di una data frazione 8. Tuttavia, la preparazione di gradienti continui è più laborioso e non è necessaria per molte applicazioni. Gradienti discontinui sono relativamente facili da preparare e possono essere usate per separare le proteine in poche frazioni, generalmente definiti. Gradienti discontinui che sono costituiti da tre strati di saccarosio degli crescente molarità sono stati ampiamente utilizzati per isolare le proteine associate alla membrana plasmatica sinaptica (SPM). Questa frazione membrana plasmatica sinaptica può essere ulteriormente elaborato per la fractio densità post-sinaptican (PSD) per trattamento detergente e l'isolamento della frazione detergente-insolubili.
Quando questo processo è stato descritto nel 1960 del 9,10, microscopia elettronica è stato utilizzato per dimostrare gli organelli e membrane che circa definiscono la membrana plasmatica sinaptica e frazioni di densità post-sinaptici 9-14. Questi studi hanno dimostrato l'inclusione delle membrane pre e post-sinaptici e vescicole sinaptiche nella frazione SPM; dopo il trattamento detergente principalmente l'elettrone-densi, densità post-sinaptica erano visibili. Nella procedura, uno shock ipotonico viene utilizzato per pizzicare fuori i processi sinaptici dal corpo cellulare 10. Questo passaggio sfrutta il fatto che i mitocondri sono più resistenti agli shock osmotico e rimangono intatte, e quindi sedimentare sul fondo del gradiente di saccarosio (Figura 1).
Usando la stessa tecnica di arricchimento, le frazioni SPM e PSD erano di prima biochimicamentedefinito mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide e sequenziamento dei principali componenti proteiche 15-17. Blot Successivamente occidentale è stato utilizzato per rilevare e quantificare i livelli di proteine sinaptiche e definire ulteriormente queste frazioni (Figura 2). Abbiamo utilizzato questa tecnica nei nostri laboratori di quantificare i cambiamenti nei livelli sinaptici del trasportatore della dopamina che si verificano quando il locus Slc6a3 viene duplicato nei topi 18. Abbiamo anche usato questa tecnica in recettori NMDA topi deficienti per scoprire riduzioni specifiche per sinapsi in proteine che fanno parte della DISC1 interattoma 19.
E 'evidente da analisi western blot che le frazioni SPM contengono proteine di membrana delle vescicole sinaptiche, marcatori degli endosomi, proteine mitocondriali, membrana associata enzimi sintetici e molecole di trasduzione del segnale, così come componenti integrali della densità post-sinaptica e membrane plasmatiche sinaptiche 20-23. Efrazioni PSD Ven possono avere contaminazione con abbondanti proteine mitocondriali e può essere necessario eseguire una seconda sedimentazione sfumatura o fasi di purificazione aggiuntivi per rimuoverli 13. Recentemente, spettrometria di massa quantitativa ha fornito un elenco di oltre 100 proteine nei soli densità post-sinaptica, così come un'indicazione della relativa abbondanza di questi componenti 24,25.
Ci sono diversi passaggi della procedura che sono fondamentali per un esito positivo. Nel passaggio 3, è importante che un grado costante di omogeneizzazione è ottenuta per ogni campione. Quando omogeneizzando tessuto con l'omogeneizzatore a motore, una velocità costante viene utilizzata non solo per la rotazione del pestello, ma anche con il numero di colpi. Il tempo di incubazione durante lo shock osmotico deve essere preciso, dal momento omogeneizzazione estesa o incubazione nella soluzione ipotonica si lisare…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).
1M HEPES, pH 7.4 | BioShop | HEP003.100 | |
HEPES | BioShop | HEP001.500 | |
Sucrose | BioShop | SUC507.1 | |
EDTA | BioBasic | EB0185 | |
PMSF | BioShop | PMS123.5 | |
Aprotinin | BioShop | APR600.1 | |
Leupeptin | BioShop | LEU001.1 | |
Pepstatin | BioShop | PEP605.5 | |
Benzamidine | BioShop | BEN601.25 | |
Sodium fluoride | BioShop | SFL001.100 | |
Sodium pyrophosphate | BioShop | SPP310.100 | |
Sodium orthovanadate | BioShop | SOV664.10 | |
β-glycerophosphate | BioShop | GYP001.10 | |
Triton X-100 | BioShop | TRX506.500 | |
18G x 1 ½” needle | BD | 305196 | |
1cc syringe | BD | 309659 | |
Name of Equipment | Company | Catalog number | |
Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23 | VWR | KT885450-0023 | |
IKA Model RW 16 Basic Stirrer | IKA Works | 2572100 | |
Sorvall SM-24 Fixed Angle Rotor | ThermoScientific | 29017 | |
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | ThermoScientific | 46910 | |
Thinwall Polyallomer Tubes (13.2mL) | Beckman Coulter | 331372 | |
SW 41 Ti Rotor Swinging Bucket | Beckman Coulter | 331362 | |
Beckman L-80 Floor Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
Thickwall Polycarbonate Tubes (3.5mL) | Beckman Coulter | 349622 | |
TLA-100.3 Fixed Angle Rotor | Beckman Coulter | 349481 | |
Beckman TL-100 Tabletop Ultracentrifuge | Beckman Coulter |