Mouse Dorsal Skinfold Odası'nda İskemik Doku Yaralanması: Bir Cilt Flap Model Akut Kalıcı iskemisi Araştırma
Summary
Sunulan murin dorsal Deri kıvrım odasının penceresi kas deri flebi akut kalıcı iskemi bir bölge görüntüler. Mikrovasküler ve hemodinaminin miktarının doğrudan ve tekrarlayan değerlendirmesi için Intravital epi-floresan mikroskopi izin verir. Morfolojik ve hemodinamik sonuçlar daha histolojik ve moleküler analizler ile ilişkili olabilir.
Abstract
Derin uzmanlık ve ileri cerrahi tekniklere rağmen, geniş doku nekrozuna yara arıza değişen iskemi kaynaklı komplikasyonlar hala özellikle rekonstrüktif flep cerrahisi, yaşanıyor. Çoklu deneysel flep modelleri altında yatan nedenleri ve mekanizmalarını analiz etmek ve iskemik komplikasyonları önlemek için tedavi stratejileri araştırmak için geliştirilmiştir. En modelleri sınırlayıcı faktör, doğrudan ve tekrar tekrar mikrovasküler mimarisi ve hemodinamikleri görselleştirmek için eksik olasılığıdır. Protokolün amacı bu daha önce belirtilen eksik unsurları affiliating köklü bir fare modeli sunmaktır. Harder ve ark. Tedavi edilmeyen muhafaza edilmesi durumunda 10 gün sonra% 50 nekroz ~ akut kalıcı iskemi ve sonuçları uğrar rastgele bir perfüzyon desenli bir kas deri flebi modeli geliştirmiştir. Intravital epi-floresan mikroskop yardımı ile, bu odacık model tekrarlayan görselleştirme sağlarmorfolojisi ve zamanla farklı ilgi bölgelerinde hemodinamik. Böyle apoptoz, inflamasyon, mikrovasküler sızıntı ve anjiyogenez gibi ilişkili süreçler incelenmiş ve immünhistokimyasal ve moleküler protein deneyleri korele edilebilir. Bugüne kadar, model, kansızlığın meydan doku pre, peri etkisi ve postconditioning araştıran yayımlanmış birkaç deneysel çalışmalarda yapılabilirliğini ve tekrarlanabilirlik kanıtlamıştır.
Introduction
Rekonstrüktif cerrahi maruz tendon kemik implant materyalin kapsamı kanatların kullanımına dayanır. Bir flep arteriyel giriş ve venöz çıkışı garanti kendi vasküler pedikül üzerinde aktarılan doku bloktur. Geniş uzmanlık ve transfer edilecek kapakların çeşitli varlığına rağmen, toplam doku kaybı yara arıza değişen iskemi kaynaklı komplikasyonlar hala rastlanmaktadır. Sekonder konservatif tedavi ve iyileşme minör doku nekrozu sonrasında beklenen Oysa, önemli flep nekroz genellikle cerrahi, yara klima ve ikincil yeniden yapılanma dahil cerrahi revizyon gerektirir. Bu, morbidite artar hastanede kalış süresini uzatır ve dolayısıyla artan sağlık maliyetleri yol açar.
Arteriyel girişi gelen en uzak distal bölgesinde bir damar tanımlanmamış desen veya rastgele perfüze alanları ile Flaps iskemik hasara yatkındır. Acco rdingly, çok sayıda deneysel ve klinik çalışmalar hem de nekroz gelişimini değerlendiren, eksenel model flepler (tanımlanmış kanlanma) ve rasgele model flepler (tanımlanmamış kan temini) 1-3. Ana bulgular yaygın nekrotik alanın büyüklüğü makroskopik değerlendirilmesi dayanmaktadır. Nedenleri ve doku nekrozu mekanizmalarını değerlendirmek üzere daha ayrıntılı olarak, çeşitli çalışmalar mikrodolaşımında analizi üzerinde duruldu. Farklı teknikler polarografik elektrotlar 4-5 ile doku oksijen geriliminin analizi, hem de lazer Doppler flowmetri 6-7, boya difüzyonu 8 ve mikrosferler 10/9 kullanarak kan akışının ölçümü de dahil olmak üzere, doku perfüzyonunu ölçmek için kullanılmıştır. Bu teknikler, ancak, sadece doku perfüzyonunun dolaylı parametreleri ölçmek için izin ve bir flep ilgi bireysel alanda microhemodynamic işlemlerin herhangi bir morfolojik analizine imkan yok.
t "> Sandison diye tavşanlarda 11 gerçekleştirilen in vivo çalışmalarda, uzun süreli için şeffaf bir odasını kullandı kim birinci olmak bilinen 1943 yılında -. Yaklaşık 20 yıl sonra – Algire uygulanabilir olması için böyle bir şeffaf odasına adapte ilk Tümör hücrelerinin 12 mikro-implantların davranışlarını incelemek amacıyla farelerde. Nedeniyle fareler gevşek cilt hayvanları sözde ve sonraki yıllarda üzerinde bazı teknik iyileştirmelerden sonra, Lehr ve co-işçi gibi adapte başardık aslında Daha küçük ve hafif bir titanyum bölmeyi üreten bir sırt deri altı bölme. Bu bölme, intravital floresan mikroskobu, morfolojik ve mikro-özelliklerden sayısı ve farklı fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında zaman içinde değişikliklerin doğrudan ve tekrarlayan görüntülenmesi için bir teknik, bu tür kullanılarak değerlendirilmesini mümkün kılmıştır iskemi-reperfüzyon hasarı 13 olarak.Pe soruşturmanormal ve patolojik şartlar altında cilt, kas ve kemik flep rfusion iki eğilim oluştu: Birincisi, böyle bir fare 14 pediküllü kulak kepçesi gibi dorsal Deri kıvrım odasını kullanmayın "akut" flep modelleri, yanal merkezli ada flep hamster 15 ve sıçanlarda 16 pedikül bileşik flep. İkinci olarak, dorsal deri kıvrım odası izinleri tekrarlayan mikrosirkülatuar ile bir flep kombinasyonu intravital floresan mikroskobu ile birkaç gün boyunca analiz "kronik" flap modeli. Bu fare 17'nin deri altı bölmesi içinde entegre edilmiş bir rasgele perfüze muskülokutan kanat oluşur. Genişliği-uzunluk oranı, akut kalıcı iskemi durum sürekli olarak 10-14 gün kanat yüksekliği sonra,% 50 kanat doku nekrozu ~ sonuçlanan şekilde seçilmiştir. Doku nekrozu Bu tekrarlanabilir ölçüde, koruyucu (yani gelişimi les hem daha değerlendirilmesine olanaks nekrozu) ve zararlı etmenler (yani, kapak patofizyolojisi daha nekroz gelişimi). Son yıllarda, farklı peri öncesi ve doku koruyucu maddelerin 18-24 idaresi ve ısı 25 ve shockwaves 26 gibi fizyolojik stres yerel uygulama da dahil olmak üzere son şartlandırma prosedürleri, etkisini gösteren çok sayıda deneysel yayınlar, ortaya çıkmıştır.
Nekroz, mikrovasküler morfolojisi ve mikrosirkülatuar parametrelerin kantitatif analizleri, immünohistokimyasal analizler ve protein deneyleri korele edilebilir. Vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), nitrik oksit sentaz (NOS) Nükleer Faktör kappa B (NF-KB) ve ısı şoku proteinlerinin (HSP-32 de dahil olmak üzere farklı proteinler ve molekül: heme oksijenaz 1 (HO-1) ve HSP- 70) doku korumada bir rol oynadığı gösterilmiştir. Bu bölme flep modeline dayanarak, iki modifikasyonlar accueillante geliştirilmiştirr eksenel desen perfüzyon ile 28 pediküllü flep deri grefti iyileşmesi 27 ve Anjiyojenik gelişmeler sırasında neovaskülarizasyonunu mikrodolaşımın analiz etmek. Biz fare Deri kıvrım odasında bir kansızlığın meydan muskülokutan kanadı içeren bir güvenilir ve tekrarlanabilir bir model sunuyoruz. Bu model Intravital epi-floresan mikroskop ile mikrodolaşımında ve hemodinami görselleştirme ve kantifizasyonunu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Klinik sonucu iskemik komplikasyonları azaltmak ve böylece iyileştirmek için, eleştirel perfüze flep dokusunda patofizyolojik süreçlerin daha detaylı bilgisi gereklidir. Akut kalıcı iskemi taklit yeni hayvan modellerinin geliştirilmesi, bu nedenle zorunludur. Buna göre, örneklenmiş kanat dokusunun immünohistokimyasal ve moleküler analiz ile ilişkili olabilir kas ve deri damarsal çeşitli parametrelerin tekrarlayan, morfolojik, dinamik ve fonksiyonel gerçek zamanlı değerlendirilmesini sağlayan bir …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz görüntü düzenleme Katharina HABERLAND teşekkür ederiz. Finansman: kıdemli yazar, yeni bir araştırma laboratuvarı kurmak için Technische Universität München bir KKF Grant aldı.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57Bl/6 mice 6-8w 20-22g | Charles River | ||
| depilation cream | Veet | any depilation cream | |
| titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| cover glass | Volab | custom-made cover glass 11,8mm in diameter | |
| fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0,9% | |||
| desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1ml syringes | |||
| surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | any surgical skin marker and flexible ruler |
| pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| fine anatomic forceps | |||
| micro-forceps | |||
| hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| screwdriver | wiha | 685 | |
| snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25mm |
| wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160mm |
| trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| magnification glasses | |||
| intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | range 1: 350-390nm excitation wavelength split 395 / 402-448nm; range 2: 460-488nm, split 495nm / 500-557nm; range 3: 567-602nm, split 610nm / 615-infinite |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552nm, split 560, emission 575-640nm |
| 2,5x objective NA=0,06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2,5x/0.06 |
| 5x objective NA=0,16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5x/0.16 M27 |
| 10x objetive NA=0,30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27 |
| 20x objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27 |
| 50x objective NA=0,55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50x/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause repiratory irritat |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
References
- McFarlane, R., De Young, G., Henry, R. The design of a pedicle flap in the rat to study necrosis and its prevention. Plast Reconstr Surg. 35, 177-182 (1965).
- Finseth, F., Cutting, C. An experimental neurovascular island skin flap for the study of the delay phenomenon. Plast Reconstr Surg. 61, 412-420 (1978).
- Petry, J. J., Wortham, K. A. The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat. Plast Reconstr Surg. 74, 410-413 (1984).
- Achauer, B. M., Black, K. S., Litke, D. K. Transcutaneous PO2 in flaps: a new method of survival prediction. Plast Reconstr Surg. 65, 45-45 (1980).
- Vollmar, B., Menger, M. D. Assessment of microvascular oxygen supply and tissue oxygenation in hepatic ischemia/reperfusion. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 403-408 (1997).
- Menger, M. D., Barker, J. H., Messmer, K. Capillary blood perfusion during postischemic reperfusion in striated muscle. Plast Reconstr Surg. 89, 1104-1114 (1992).
- Uhl, E., Rösken, F., Curri, S. B., Menger, M. D., Messmer, K. Reduction of skin flap necrosis by transdermal application of buflomedil bound to liposomes. Plast Reconstr Surg. 102, 1598-1604 (1998).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T., Sasaki, G. H. Assessment of the fluorescein dye test for prediction of skin flap viability in pigs. J Surg Res. 41, 173-181 (1986).
- Hjortdal, V. E., Hansen, E. S., Henriksen, T. B., Kjolseth, D., Soballe, K., Djurhuus, J. C. The microcirculation of myocutaneous island flaps in pigs studied with radioactive blood volume tracers and microspheres of different sizes. Plast Reconstr Surg. 89, 116-122 (1992).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T. Assessment of microsphere technique for measurement of capillary blood flow in random skin flaps in pigs. Plast Reconstr Surg. 74, 513-521 (1984).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit’s ear. The Anatomical Record. 28, 281-287 (1924).
- Algire, G. H. An Adaptation of the Transparent-Chamber Technique to the Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 4, 1-11 (1943).
- Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. Am J Pathol. 4, 1055-1062 (1993).
- Barker, J. H., et al. An animal model to study microcirculatory changes associated with vascular delay. Br J Plast Surg. 52, 133-142 (1999).
- Erni, D., Sakai, H., Banic, A., Tschopp, H. M., Intaglietta, M. Quantitative assessment of microhemodynamics in ischemic skin flap tissue by intravital microscopy. Ann Plast Surg. 43, 405-414 (1999).
- Roesken, F., Schäfer, T., Spitzer, W. J., Vollmar, B., Menger, M. D. In vivo analysis of the microcirculation of osteomyocutaneous flaps using fluorescence microscopy. Br J Plast Surg. 52, 644-652 (1999).
- Harder, Y., Amon, M., Erni, D., Menger, M. D. Evolution of ischemic tissue injury in a random pattern flap: a new mouse model using intravital microscopy. J Surg Res. 121, 197-205 (2004).
- Harder, Y., Contaldo, C., Klenk, J., Banic, A., Jakob, S. M., Erni, D. Preconditioning with monophosphoryl lipid A improves survival of critically ischemic tissue. Anesth Analg. 100, 1786-1792 (2005).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoieton protects critically perfused flap tissue. Ann Surg. 248, 919-929 (2008).
- Harder, Y., et al. Erythropoietin reduces necrosis in critically ischemic myocutaneous tissue by protecting nutritive perfusion in a dose-dependent manner. Surgery. 145, 10-1016 (2009).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoietin-induced upregulation of endothelial nitric oxide synthase but not vascular endothelial growth factor prevents musculocutaneous tissue from ischemic damage. Lab Invest. 90, 40-51 (2010).
- Rezaeian, F., Ong, M. F., Harder, Y., Menger, M. D. N-acetylcysteine attenuates leukocytic inflammation and microvascular perfusion failure in critically ischemic random pattern flaps. Microvasc Res. 82, 28-34 (2011).
- Rezaeian, F., et al. Ghrelin protects musculocutaneous tissue from ischemic necrosis by improving microvascular perfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, 603-610 (2012).
- Rezaeian, F., et al. Long-term preconditioning with Erythropoietin reduces ischemia-induced skin necrosis. Microcirculation. , (2013).
- Harder, Y., et al. Heat shock preconditioning reduces ischemic tissue necrosis by heat shock protein (HSP)-32-mediated improvement of the microcirculation rather than induction of ischemic tolerance. Ann Surg. 242, 869-878 (2005).
- Tobalem, M., et al. Local shockwave-induced capillary recruitment improves survival of musculocutaneous flaps. J Surg Res. 184, 1196-1204 (2013).
- Lindenblatt, N., Calcagni, M., Contaldo, C., Menger, M. D., Giovanoli, P., Vollmar, B. A new model for studying the revascularization of skin grafts in vivo: the role of angiogenesis. Plast Reconstr Surg. 122, 169-1680 (2008).
- Schweizer, R., et al. Morphology and hemodynamics during vascular regeneration in critically ischemic murine skin studied by intravital microscopy techniques. Eur Surg Res. 47, 222-230 (2011).
- Klyscz, T., Jünger, M., Jung, F., Zeintl, H. Cap image—a new kind of computer-assisted video image analysis system for dynamic capillary microscopy. Biomed. Tech. 42, 168-1675 (1997).
- Gross, J. F., Aroesty, J. Mathematical models of capillary flow: a critical review. Biorheology. 9, 225-264 (1972).
- Menger, M. D., Pelikan, S., Steiner, D. Microvascular ischemiareperfusion injury in striated muscle: significance of ‘reflow paradox. Am J Physiol. 263 (6 part 2), 1901-1906 (1992).
