प्रोटीन विश्लेषण के लिए सतत मान्यता पैटर्न उत्पन्न इलेक्ट्रॉनिक जीभ
Summary
A novel approach is described for construction of electronic tongue (eT), which greatly simplifies the design and production of sensing materials, and allows the eT to generate continuous evolution profiles and landscapes for samples in liquid. The obtained eT is efficient for common protein analysis such as discrimination.
Abstract
In current protocol, a combinatorial approach has been developed to simplify the design and production of sensing materials for the construction of electronic tongues (eT) for protein analysis. By mixing a small number of simple and easily accessible molecules with different physicochemical properties, used as building blocks (BBs), in varying and controlled proportions and allowing the mixtures to self-assemble on the gold surface of a prism, an array of combinatorial surfaces featuring appropriate properties for protein sensing was created. In this way, a great number of cross-reactive receptors can be rapidly and efficiently obtained. By combining such an array of combinatorial cross-reactive receptors (CoCRRs) with an optical detection system such as surface plasmon resonance imaging (SPRi), the obtained eT can monitor the binding events in real-time and generate continuous recognition patterns including 2D continuous evolution profile (CEP) and 3D continuous evolution landscape (CEL) for samples in liquid. Such an eT system is efficient for discrimination of common purified proteins.
Introduction
सटीक और तेजी से प्रोटीन संवेदन तरीकों चिकित्सा निदान और प्रोटिओमिक्स में बहुत महत्वपूर्ण हैं. ऐसे biochips के रूप में शास्त्रीय प्रोटीन का पता लगाने सरणियों, "ताला और चाबी" मान्यता सिद्धांत पर आधारित है और इस तरह के aptamers, एंटीबॉडी, या mimetics के रूप में विशिष्ट रिसेप्टर्स की आवश्यकता है.
हाल के वर्षों में, मानव घ्राण और gustation से प्रेरित अंतर संवेदन एक विकल्प 1 रूप में उभरा है. इस इलेक्ट्रॉनिक नाक / जीभ (एन / ईटी) दृष्टिकोण लक्ष्य अणुओं के लिए अत्यधिक विशिष्ट या चयनात्मक होने की जरूरत नहीं है कि पार प्रतिक्रियाशील रिसेप्टर्स (CRRs), की एक सरणी के लिए analytes की बाध्यकारी अंतर पर आधारित है इस प्रकार श्रमसाध्य बढ़ना करने की अनुमति अत्यधिक चयनात्मक रिसेप्टर्स के विकास की प्रक्रिया. यह अपनी पहचान की अनुमति, एक अंगुली की छाप की तरह, प्रत्येक नमूना के लिए एक विशिष्ट पैटर्न बनाता है कि सभी रिसेप्टर्स की संयुक्त प्रतिक्रिया है.
चुनाव के विकास के लिए दो प्रमुख चुनौतियोंप्रभावी प्रोटीन संवेदन के लिए इलेक्ट्रॉनिक नाक / जीभ संरचनात्मक समान analytes और बाध्यकारी घटना के लिए उपयुक्त पारगमन प्रणाली के बीच भेद करने की क्षमता है कि संवेदन तत्वों का उत्पादन कर रहे हैं. अब तक, पढ़ाई सरणी विकास 2 के लिए विभिन्न तरीकों की सूचना दी है. एक अध्ययन में उदाहरण के लिए प्रोटीन की एक सरणी आधारित पहचान विभिन्न अमीनो एसिड या प्रोटीन और के लिए अलग से चार्ज परिधि के लिए समानता के लिए एक हाइड्रोफोबिक कोर रखने अंतर रिसेप्टर्स प्रदान करने के लिए dipeptides को carboxyl समूहों युग्मन द्वारा टेट्रा-carboxyphenylporphyrin डेरिवेटिव से तैयार CRRs का उपयोग कर विकसित किया गया था प्रदान अंतर बंधन. इस प्रणाली का उपयोग करना, विभिन्न प्रोटीन और प्रोटीन मिश्रण analytes 3,4 के साथ बातचीत पर रिसेप्टर्स की प्रतिदीप्ति शमन मापने के द्वारा की पहचान की गई. एक अन्य अध्ययन में, एक hexasubsti पर एक मिश्रित रास्ते में संश्लेषित त्रिपेपटाइड और boronic एसिड moieties युक्त 29 CRRs के एक पुस्तकालयtuted बेंजीन पाड़ एक सूचक तेज वर्णमिति पता लगाने 5,6 के साथ प्रोटीन संवेदन के लिए विकसित किया गया था. इस तरह के एक डिजाइन के साथ, प्रत्येक रिसेप्टर ग्लाइकोप्रोटीन से प्रोटीन के भेदभाव में सहायता पेप्टाइड बाहों में विचरण पर आधारित प्रोटीन, और boronic एसिड के साथ अंतर बाध्यकारी क्षमता दिखाया. अभी हाल ही में एक anionic फ्लोरोसेंट बहुलक पाली (पी phenyleneethynylene) (पीपीई) के साथ संयुग्मित अलग cationic functionalized सोना नैनोकणों से बना एक सरणी का पता लगाने और प्रोटीन 7 की पहचान करने के लिए बनाया गया है. प्रतिस्पर्धी प्रोटीन के लिए अलग मान्यता पैटर्न के उत्पादन, प्रोटीन के बीच बंधन और प्रतिदीप्ति पुनर्जीवित पीपीई / सोने nanoparticle परिसरों बुझती. इस अध्ययन में, functionalized nanoparticle प्रोटीन बातचीत nanoparticle अंत समूहों के भौतिक गुणों अलग से देखते थे. इसके अलावा, यह इस दृष्टिकोण जटिल और प्रोटीन युक्त मध्यम ऐसे में प्रोटीन विश्लेषण के लिए प्रभावी है कि दिखाया गया थाphysiologically प्रासंगिक सांद्रता में मानव सीरम के रूप में, इस प्रकार की बीमारी राज्यों 8 निदान के लिए वास्तविक नमूने की रूपरेखा में एट के संभावित दिखा.
बहुत ही होनहार हालांकि, इन पद्धतियों के कुछ निहित सीमाएं हैं. वे डिजाइन और काफी जटिल संरचनाओं के साथ 5 से 29 CRRs से synthesizing की आवश्यकता होती है. इसके अलावा, प्रत्येक माप निम्नलिखित रीसेट है कि घ्राण प्रणाली के विपरीत, प्रोटीन संवेदन नमूना प्रति एक सरणी की तैयारी की आवश्यकता है. अंत में, निगरानी वास्तविक समय बाध्यकारी घटनाओं बेहद मुश्किल हैं.
इस संदर्भ में एक मिश्रित दृष्टिकोण विभिन्न भौतिक गुणों के साथ सरल और आसानी से सुलभ अणुओं की एक छोटी संख्या का उपयोग करके प्रस्तावित किया गया था (तटस्थ नकारात्मक आरोप लगाया सकारात्मक आरोप लगाया हाइड्रोफिलिक, हाइड्रोफोबिक,,,, आदि.) बिल्डिंग ब्लॉक्स (बीबीएस) के रूप में 9. करने के लिए मिश्रण में अलग BBs और नियंत्रित अनुपात मिश्रण और अनुमति देकर एक की सोने की सतह पर स्वयं को इकट्ठाचश्मे, प्रोटीन बंधन के लिए उपयुक्त गुणों की विशेषता मिश्रित सतहों की एक सरणी बनाया गया था. विशेष रूप से, इस प्रणाली पर आत्म इकट्ठे monolayers तेजी से और कुशलता से उत्पादित करने के लिए विविध मिश्रित पार प्रतिक्रियाशील रिसेप्टर्स (CoCRRs), सक्रिय करने के एक बेहद अलग फैशन में सतह के गुणों की एक श्रृंखला के लिए आसान ट्यूनिंग अनुमति देते हैं. प्रोटीन संवेदन एक ऑप्टिकल पहचान प्रणाली का उपयोग किया गया था, plasmon अनुनाद इमेजिंग (SPRI) सतह. संक्षेप में, एक एलईडी से एक व्यापक बीम रंग ध्रुवीकृत प्रकाश चश्मे की सतह पर पूरे CoCRR सरणी क्षेत्र illuminates. एक उच्च संकल्प सीसीडी वीडियो कैमरा CoCRR सरणी के सभी स्थानों में वास्तविक समय का अंतर चित्र प्रदान करता है. यह बाध्यकारी घटनाओं और गतिज प्रक्रियाओं 10 पर विस्तृत जानकारी प्रदान करने CoCRR सरणी की सतह पर स्थानीय परिवर्तनों के सभी कब्जा. इस बीच, इमेजिंग सॉफ्टवेयर की मदद से, स्पॉट के लिए इसी SPR चित्र स्वतः परावर्तन versu की विविधताओं में बदल रहे हैंsensorgrams बुलाया गतिज बाध्यकारी घटता की एक श्रृंखला पैदा करने, समय है. इस प्रकार, spri बंधन घटनाओं के लेबल से मुक्त,, तुल्यकालिक, समानांतर और वास्तविक समय अवलोकन की अनुमति देता है. साथ ही, प्राप्त CoCRR सरणी प्रोटीन विश्लेषण के लिए regenerable और पुन: प्रयोज्य है.
इस प्रोटोकॉल इमारत ब्लॉक के रूप में केवल दो छोटे अणुओं का उपयोग करके इलेक्ट्रॉनिक जीभ का निर्माण का वर्णन और spri के साथ प्राप्त की सतत मान्यता पैटर्न के आधार पर आम प्रोटीन के विश्लेषण के लिए अपने आवेदन को दिखाता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस एट के निर्माण के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम प्रणाली का अच्छा reproducibility सुनिश्चित करने के लिए समर्पित कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, BB1 और BB2 के ग्यारह शुद्ध और मिश्रित समाधान में ग्लिसरॉल का 10%, उनका उपयोग करने स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Ph.D. grant of LANEF in Grenoble for support of Laurie-Amandine Garçon. This work was financially supported by the French National Research Agency (ANR-grant 06-NANO-045).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SPRi apparatus | Horiba Scientific-GenOptics | SPRi apparatus is placed in a temperature regulated incubator at 25°C. | |
| Incubator | Memmert | ||
| Syringe pump | Cavro scientific instruments | Cavro XLP 6000 | |
| Micro Elite Degasser | Alltech | AT590507 | |
| 6-port medium pressure injection valve | Upchurch Scientific | The volume of injection loop used is 500 µl. | |
| Femto plasma cleaner (version 7) | Diener Electronic | On-line degassing system with 2 channel. | |
| Spotter | Siliflow | It is a non-contact piezoelectric spotter. | |
| SPRi-Biochip | Horiba Scientific-GenOptics | 36000067 | The prism is made of a high refractive index glass prism coated with a thin gold film (45 nm) and specially developed for imaging purposes. |
| erythrina cristagalli lectin | Sigma-Aldrich | L5390 | |
| arachis hypogaea lectin | Sigma-Aldrich | L0881 | |
| myoglobin | Sigma-Aldrich | M1882 | |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| CXCL12α | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| CXCL12γ | Provided by Dr. Hugues Lortat-Jacob, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| sulfated lactose | Provided by Prof. David Bonnaffé, for preparation details, see supporting information in reference 9 | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| tween 20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 |
References
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