gDNA التخصيب من قبل القائم على تقنية Transposase لتحليل NGS من تسلسل كامل ل<em> BRCA1</em>،<em> BRCA2</em>، و 9 الجينات المسؤولة عن إصلاح الحمض النووي الأضرار
Summary
gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.
Abstract
فتحت الاستخدام الواسع النطاق للجيل القادم تسلسل آفاقا جديدة لأبحاث السرطان والتشخيص. سوف NGS جلب كميات هائلة من بيانات جديدة عن السرطان، وخاصة سرطان علم الوراثة. والمعرفة الحالية والاكتشافات المستقبلية تجعل من الضروري لدراسة عدد كبير من الجينات التي يمكن أن تشارك في الاستعداد الوراثي للسرطان. في هذا الصدد، قمنا بتطوير تصميم Nextera لدراسة الجينات كاملة 11 المشاركة في إصلاح الحمض النووي الضرر. وقد تم تطوير هذا البروتوكول لدراسة الجينات بأمان 11 (ATM، BARD1، BRCA1، BRCA2، BRIP1، CHEK2، PALB2، RAD50، RAD51C، RAD80، وTP53) من المروج ل3'-UTR في 24 مريضا في وقت واحد. هذا البروتوكول، على أساس تكنولوجيا transposase وإثراء gDNA، ويعطي ميزة كبيرة من حيث الوقت لتشخيص بفضل الجيني لعينة المتنوعة. هذا البروتوكول يمكن استخدامها بأمان مع gDNA الدم.
Introduction
في عام 2010، ما يقرب من 1.5 مليون شخص (النساء أساسا) تطوير سرطان الثدي في جميع أنحاء العالم. وتشير التقديرات إلى أن 5 إلى 10٪ من هذه الحالات كانت وراثية. قبل 20 عاما تقريبا، تم تحديد BRCA1 و BRCA2 كما تشارك في الثدي وراثي وسرطان المبيض 1. منذ حوالي 15 عاما، تم التسلسل المناطق الترميز BRCA1 و BRCA2 لتحديد استعداد وراثي لسرطان الثدي والمبيض. تم الكشف عن تغييرات في BRCA1 و BRCA2 في 10 إلى 20٪ من الأسر المختارة 2 يشير إلى أن تحليل هذه المناطق ليست كافية لفحص فعالية. مؤخرا، أبرزت تحليل تسلسل غير الترميز (المروج، الإنترونات، 3'UTR) من BRCA1 و BRCA2 أن الطفرات الجديدة / الاختلافات يمكن ربط لخطر الاصابة بسرطان الثدي 3-6.
وتشارك BRCA1 و BRCA2 البروتينات في إصلاح إعادة التركيب مثلي (HHR)، التي أنجزت من قبل العديد من الشركاء 7. في حين التعديلات BRCA1 أو BRCA2 في تحفز عيوب في إصلاح الحمض النووي، والشركاء الآخرين قد يؤثر أيضا من خطر الإصابة بسرطان الثدي. ويبدو أن هذه الفرضية قد تم التحقق من صحة منذ BRIP1 8 و 9 PALB2 يكون لها تأثير مؤكد على سرطان عنق الرحم والثدي، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، الأخريين "مخاطر معتدلة" سرطان الثدي جينات القابلية، أجهزة الصراف الآلي وCHEK2، يمكن أيضا أن تدرس بشكل روتيني 10.
وانطلاقا من هذه الدراسات، قررنا وضع بروتوكول لتحليل جينات 11 (ATM، BARD1، BRCA1، BRCA2، BRIP1، CHEK2، PALB2، RAD50، RAD51C، RAP80، وTP53) في وقت واحد باستخدام 24 مريضا من السهل جدا ونسبيا بروتوكول سريع على أساس تكنولوجيا transposase، مع تخصيب وتسلسل على جهاز الإنتاجية المتوسط. شكرلهذه التقنية، فإننا تسلسل الجينات كاملة من بداية المروج إلى نهاية 3'-UTR، باستثناء RAP80، والتي لم تغطى منطقة intronic من 2،500 سنة مضت (Chr5: 176،381،588-176،390،180). هذا يمثل ما مجموعه حوالي 1000300 BP درس مع 2،734 التحقيقات. عادة، يتم تحليل BRCA1 و BRCA2 تسلسل exonic بواسطة سانجر التسلسل الذي يحتاج 1.5 أشهر لأقل من 20 مريضا. مع هذا البروتوكول (الشكل 1)، في الوقت نفسه، يمكن تحليل الجينات 11 كاملة لأكثر من 75 مريضا.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد وفرت انتشار استخدام الأجهزة والتقنيات NGS فرص جديدة في دراسة السرطان والاضطرابات الوراثية. بالإضافة إلى تسلسل الجينوم كله أو RNA تسلسل وتحليل كمية كبيرة من متواليات gDNA مختارة في العديد من المرضى في وقت واحد يوفر فرص كبيرة في التشخيص. هنا، قمنا بتطوير تصميم معين (حسب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Ligue contre le Cancer de Côte d’Or and the Centre Georges-François Leclerc for their financial support. We thank Philip Bastable for the editing of the manuscript.
Materials
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software |
|
| Illumina | Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new> Manufacturer website tool |
References
- Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
- Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
- Cox, D. G., et al. Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers. Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).
- Maia, A. T., et al. Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res. 14 (2), 63 (2012).
- Anczuków, O., et al. BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy. Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).
- Brewster, B. L., et al. Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3’UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site. Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).
- Ma, X. D., et al. First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer. Gene. 524 (2), 208-213 (2013).
- Haanpää, M., Pylkäs, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families. BMC Med. Genet. 14, 82 (2013).
- Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation. Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).
- Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice. Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).
- Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing. J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).
- Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing. Plos One. 6, e28240 (2011).
- de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing. Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).
- . The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers. J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).
- Levy-Lahad, E., Friedman, E. Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).
- Risch, H. A., et al. Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada. J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).
- Slater, E. P., et al. PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families. Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).
- Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W. BRCA and pancreatic cancer. J.O.P. 14 (4), 325-328 (2013).
