ADNg enrichissement par une technologie basée Transposase-NGS Analyse de la séquence plénier de<em> BRCA1</em>,<em> BRCA2</em>, et 9 gènes impliqués dans la réparation des dommages de l'ADN
Summary
gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.
Abstract
L'utilisation généralisée de séquençage de nouvelle génération a ouvert de nouvelles avenues pour la recherche sur le cancer et le diagnostic. NGS apportera d'énormes quantités de données sur le cancer, et en particulier la génétique du cancer. Les connaissances actuelles et des découvertes futures, il sera nécessaire d'étudier un grand nombre de gènes qui pourraient être impliqués dans une prédisposition génétique au cancer. À cet égard, nous avons développé une conception Nextera d'étudier 11 gènes complets impliqués dans la réparation des dommages de l'ADN. Ce protocole a été développé pour étudier en toute sécurité 11 gènes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, et TP53) de promoteur de 3'-UTR chez 24 patients simultanément. Ce protocole, basé sur la technologie de transposase et enrichissement ADNg, donne un grand avantage en termes de temps pour le diagnostic génétique grâce à multiplexage déguster. Ce protocole peut être utilisé en toute sécurité avec ADNg de sang.
Introduction
En 2010, près de 1,5 millions de personnes (essentiellement des femmes) ont développé un cancer du sein dans le monde entier. On estime que 5 à 10% de ces cas étaient héréditaires. Il ya près de 20 ans, BRCA1 et BRCA2 ont été identifiées comme impliquées dans héréditaire du sein et des ovaires 1. Depuis environ 15 ans, les régions codantes des gènes BRCA1 et BRCA2 ont été séquencés afin de déterminer la prédisposition génétique au cancer du sein et le cancer de l'ovaire. Des altérations dans les gènes BRCA1 et BRCA2 sont détectés chez 10 à 20% de deux familles sélectionnées suggérant que l'analyse de ces régions ne sont pas suffisantes pour le criblage efficace. Récemment, l'analyse des séquences non codantes (promoteurs, introns, 3-'UTR) de BRCA1 et BRCA2 mis en évidence que de nouvelles mutations / variations pourraient être liés à un risque accru de cancer du sein 6.3.
protéines BRCA1 et BRCA2 sont impliqués dans la recombinaison homologue réparation (RHS), qui est complété par de nombreux partenaires 7. Bien que des altérations de BRCA1 ou BRCA2 induisent des défauts de réparation de l'ADN, les autres partenaires peuvent également influer sur le risque de cancer du sein. Cette hypothèse semble avoir été validé depuis BRIP1 8 et 9 PALB2 avoir un impact avéré sur le cancer du col utérin et du sein, respectivement. En outre, deux autres gènes de prédisposition au cancer du sein "à risque modéré», ATM et CHEK2, peuvent également être étudiées systématiquement 10.
Suite à ces études, nous avons décidé de développer un protocole pour analyser 11 gènes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80, et TP53) chez 24 patients en utilisant un très facile et relativement simultanément protocole rapide basé sur la technologie de la transposase, l'enrichissement et le séquençage sur un dispositif de débit moyen. Mercicette technique, nous avons séquence des gènes complets à partir du début du promoteur à l'extrémité 3'-UTR de, à l'exception de RAP80, pour lequel une région intronique de 2500 pb n'est pas couverte (CHR5: 176,381,588-176,390,180). Cela représente un total d'environ 1.000.300 pb étudié avec 2734 sondes. Habituellement, BRCA1 et BRCA2 séquences exoniques sont analysés par séquençage de Sanger, qui a besoin de 1,5 mois de moins de 20 patients. Avec le présent protocole (figure 1), dans le même temps, les 11 gènes complets pour plus de 75 patients ont pu être analysés.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'utilisation généralisée de dispositifs et de technologies de l'END a offert de nouvelles possibilités dans l'étude du cancer et des maladies génétiques. En plus de séquençage du génome entier ou le séquençage de l'ARN, l'analyse d'une grande quantité de certaines séquences d'ADNg de nombreux patients en même temps offre de grandes perspectives dans le diagnostic. Ici, nous avons développé une conception spécifique (disponible sur demande) en utilisant la technologie Nexter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Ligue contre le Cancer de Côte d’Or and the Centre Georges-François Leclerc for their financial support. We thank Philip Bastable for the editing of the manuscript.
Materials
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software |
|
| Illumina | Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new> Manufacturer website tool |
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