gDNA Enrichment durch eine Transposase-basierte Technologie für NGS-Analyse der gesamten Sequenz von<em> BRCA1</em>,<em> BRCA2</em> Und 9 Gene in der DNA-Reparatur beteiligt Schäden
Summary
gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.
Abstract
Der weit verbreitete Einsatz von Next Generation Sequencing hat neue Wege für die Krebsforschung und Diagnostik eröffnet. NGS werden riesige Mengen neuer Daten über Krebs, und vor allem Krebsgenetik zu bringen. Aktuellen Wissensstand und zukünftige Entdeckungen machen es notwendig, eine große Anzahl von Genen, die in einem genetischen Prädisposition für Krebs beteiligt sein könnten studieren. In diesem Zusammenhang haben wir eine Nextera Design bis 11 vollständige Gene in der DNA-Reparatur beteiligt sind Schäden zu untersuchen. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um sicher zu studieren 11 Gene (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 und TP53) von Promotor zu 3'-UTR bei 24 Patienten gleichzeitig. Dieses Protokoll, basierend auf Transposase Technologie und gDNA Bereicherung, gibt einen großen Vorteil in Bezug auf die Zeit für die genetische Diagnostik durch Multiplexing zu probieren. Dieses Protokoll kann sicher mit Blut gDNA verwendet werden.
Introduction
Im Jahr 2010 fast 1,5 Millionen Menschen (im wesentlichen Frauen) entwickelt weltweit Brustkrebs. Es wird geschätzt, dass 5 bis 10% dieser Fälle waren erblich. Vor fast 20 Jahren, BRCA1 und BRCA2 identifiziert wurden, wie in erblichen Brust-und Eierstockkrebs 1 beteiligt. Seit vor etwa 15 Jahren haben BRCA1-und BRCA2-codierenden Regionen wurden sequenziert, um die genetische Prädisposition für Brust-und Eierstockkrebs zu bestimmen. Veränderungen im BRCA1 und BRCA2 sind in 10 bis 20% der ausgewählten Familien 2 nahelegt, daß die Analyse dieser Bereiche ist nicht ausreichend für eine effektive Screening nachgewiesen. Vor kurzem hat die Analyse von nicht-kodierenden Sequenzen (Promotor, Introns, 3-'UTR) von BRCA1-und BRCA2-Mutationen hervorgehoben, dass neue / Variationen könnten zu einem höheren Risiko von Brustkrebs 3-6 verknüpft werden.
BRCA1 und BRCA2-Proteine der homologen Rekombination Reparatur beteiligt (HHR), die von zahlreichen Partner 7 abgeschlossen ist. Während Veränderungen in BRCA1-oder BRCA2 induzieren Defekte in der DNA-Reparatur können die anderen Partner auch Einfluss auf das Risiko von Brustkrebs. Diese Hypothese erscheint seit BRIP1 8 bis validiert wurden und PALB2 9 haben eine nachgewiesene Wirkung auf Gebärmutterhals-und Brustkrebs sind. Zusätzlich können zwei weitere "mittlerem Risiko" Brustkrebs Anfälligkeit Gene, ATM und CHEK2, auch routinemäßig 10 untersucht werden.
Im Anschluss an diesen Studien, haben wir beschlossen, ein Protokoll bis 11 Gene (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 und TP53) bei 24 Patienten analysiert gleichzeitig über eine sehr einfache und relativ entwickeln schnell Protokoll, das auf Transposase Technologie, mit Anreicherung und Sequenzierung auf einem mittleren Durchsatz Gerät. Dankdieser Technik sequenziert wir vollständige Gene aus dem Start des Promotors bis zum Ende der 3'-UTR, außer RAP80, für die eine Intron-Region von 2.500 bp wurde nicht behandelt (CHR 5: 176,381,588-176,390,180). Dies entspricht insgesamt etwa 1.000.300 bp studierte bei 2.734 Sonden. Normalerweise sind BRCA1 und BRCA2 exonische Sequenzen durch Sanger-Sequenzierung, die 1,5 Monate weniger als 20 Patienten muss analysiert. Bei dem vorliegenden Protokoll (Abbildung 1), in der gleichen Zeit 11 komplette Gene für mehr als 75 Patienten analysiert werden konnte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der weit verbreitete Einsatz von NGS-Geräten und Technologien hat neue Möglichkeiten bei der Untersuchung von Krebs und genetische Erkrankungen vorgesehen. Neben der Sequenzierung ganzer Genome oder RNA-Sequenzierung, die Analyse einer großen Menge von ausgewählten gDNA-Sequenzen in zahlreiche Patienten bietet gleichzeitig große Perspektiven in Diagnose. Hier ein bestimmtes Design (auf Anfrage) mit Nextera Technologie, um 11 vollständige Gene bei 24 Patienten gleichzeitig mit einem mittleren Durchsatz-Sequenzierun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Ligue contre le Cancer de Côte d’Or and the Centre Georges-François Leclerc for their financial support. We thank Philip Bastable for the editing of the manuscript.
Materials
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software |
|
| Illumina | Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new> Manufacturer website tool |
References
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