の全配列のNGS解析のためのトランスポゼースベースの技術によるgDNAのエンリッチメント<em> BRCA1</em><em> BRCA2</em>、およびDNA損傷修復に関与する遺伝子9
Summary
gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.
Abstract
次世代シーケンシングの普及は、癌研究および診断のための新たな道を切り拓いてきた。 NGSは巨大な癌に対する新たなデータの量、特にがんの遺伝学をもたらすでしょう。現在の知識と未来の発見は、それが必要な癌の遺伝的素因に関与することができる遺伝子の膨大な数を研究するようになります。この点では、DNA損傷の修復に関与する11の完全な遺伝子を研究するためにエラ·デザインを開発した。このプロトコルは、安全に、同時に24人の患者に11個の遺伝子（ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK2、PALB2、RAD50、RAD51C、RAD80、およびTP53）プロモーターからの3'-UTRに研究するために開発されました。トランスポザーゼ技術とgDNAの濃縮に基づくこのプロトコルは、多重化をサンプリングする遺伝子診断のおかげで時間の面で大きな利点を提供します。このプロトコルは、安全に、血液のgDNAと共に使用することができる。
Introduction
2010年にはほぼ150万人（基本的に女性は）世界的に乳癌を開発しました。なお、これらの症例の5〜10％が遺伝性であったと推定される。ほぼ20年前、BRCA1およびBRCA2は 、遺伝性乳癌および卵巣癌1に関わると同定された。約15年前から、BRCA1およびBRCA2コード領域は、乳癌および卵巣癌の遺伝的素因を決定するために配列決定されている。 BRCA1およびBRCA2の変化は、これらの領域の分析は、効果的なスクリーニングのために十分ではないことを示唆して選択された家族2 10〜20％で検出される。最近では、BRCA1およびBRCA2の非コード配列（プロモーター、イントロン、3 – 'UTR）の分析は、新たな変異/バリエーションが乳癌3-6のリスクが高いにリンクすることができることを強調した。
BRCA1およびBRCA2タンパク質は、相同組換え修復に関与している（多数のパートナー企業7によって完成さHHR）。 BRCA1またはBRCA2の変化は、DNA修復における欠陥を誘発するが、他のパートナーはまた、乳癌のリスクに影響を及ぼし得る。この仮説はBRIP1 8以来確認されているように見えるとPALB2 9は、それぞれ、子宮頸および乳癌に対する実績のある影響を与えます。さらに、2つの他の「中程度リスク」乳癌感受性遺伝子、ATMおよびCHEK2は 、また、日常的に10研究することができる。
これらの研究に続いて、私たちは非常に簡単で、比較的を用いて同時に24人の患者に11個の遺伝子（ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK2、PALB2、RAD50、RAD51C、RAP80、およびTP53）を分析するためのプロトコルを開発することを決定中スループットデバイス上の濃縮およびシーケンシングとトランスポザーゼ技術に基づく高速プロトコル。感謝この技術は、2,500塩基対のイントロン領域をカバーされなかったRAP80、（：176,381,588-176,390,180 Chr5）を除いて、3'-UTRの端に対するプロモーターの開始から完全な遺伝子を配列決定した。これは2,734プローブを用いて研究し、約1000300塩基対の合計を表します。通常、BRCA1およびBRCA2エキソン配列は、20未満の患者について1.5カ月を必要とするサンガー配列決定によって分析される。現在のプロトコル（ 図1）を使用すると、同じ時間で、75以上の患者のための11の完全な遺伝子を解析することができた。
Protocol
Representative Results
Discussion
NGS機器や技術の普及は、がんや遺伝性疾患の研究に新たな機会を提供してきました。全ゲノムシーケンシングまたはRNA配列決定に加えて、多数の患者では、選択したgDNAシーケンスを多量の分析は、同時に診断に大きな展望を提供しています。ここでは、ミディアムスループットシークエンシングデバイス（材料/機器の表）と同時に24人の患者の11の完全な遺伝子を研究するためにネクストエ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Ligue contre le Cancer de Côte d’Or and the Centre Georges-François Leclerc for their financial support. We thank Philip Bastable for the editing of the manuscript.
Materials
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software |
|
| Illumina | Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new> Manufacturer website tool |
References
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