의 전체 순서의 NGS 분석을위한 Transposase 기반 기술에 의해 gDNA를 농축<em> BRCA1</em><em> BRCA2</emDNA 손상 복구에 참여>, 9 유전자
Summary
gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.
Abstract
차세대 시퀀싱의 광범위한 사용은 암 연구 및 진단을위한 새로운 길을 열었습니다. NGS는 거대한 암에 대한 새로운 데이터의 양, 특히 암 유전학을 가져올 것이다. 현재의 지식과 미래의 발견은 필요한 암의 유전 적 소인에 관여 할 수있는 유전자의 거대한 숫자를 연구 할 것입니다. 이러한 관점에서, 우리는 DNA 손상의 복구에 관여하는 유전자의 완전한 11 공부 Nextera 설계를 개발 하였다. 이 프로토콜은 안전하게 동시에 24 명에서 11 유전자 (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 및 TP53) 프로모터에서 3'-UTR을 연구하기 위해 개발되었다. transposase 기술과 gDNA를 농축에 따라이 프로토콜은, 다중화를 샘플링 할 수있는 유전자 진단 덕분에 시간의 측면에서 큰 장점을 제공합니다. 이 프로토콜은 혈액 gDNA를 안전하게 사용할 수있다.
Introduction
2010 년 (기본적으로 여성) 거의 1백50만명는 전 세계적으로 유방암을 개발했다. 그러나, 이들의 경우 5-10 %의 유전 있다고 추정된다. 유전성 유방암과 난소 암의 1에 관련된 거의 이십년 전, BRCA1과 BRCA2가 확인되었다. 약 15 년 전 이후로, BRCA1 및 BRCA2 코딩 영역은 유방암과 난소 암에 대한 유전 적 소인을 결정하는 순서가되었다. BRCA1 및 BRCA2의 변화는 이들 영역의 분석을 효과적으로 스크리닝 충분하지 않은 것을 시사 선택된 가족이 10-20 %가 검출된다. 최근, BRCA1 및 BRCA2의 비 – 코딩 서열 (프로모터, 인트론, 3 'UTR)의 분석은 새로운 돌연변이 / 변형 유방암 3-6의 높은 위험에 링크 될 수 있다는 것을 강조 하였다.
BRCA1과 BRCA2 단백질은 (상동 재조합 수리에 참여하고 있습니다수많은 파트너 (7)에 의해 완료 HHR). BRCA1 또는 BRCA2의 변화는 DNA 복구에 결함을 유발하지만, 다른 파트너는 유방암 위험에 영향을 미칠 수있다. 이 가설은 BRIP1 8 이후 확인 된 것으로 나타나고 PALB2 9는 각각 자궁 경부 암과 유방암에 대한 입증 영향을 미친다. 또한, 다른 두 "중등도 위험"유방암 감수성 유전자, ATM 및 CHEK2는 또한 정기적으로 열 연구 할 수있다.
이 연구에 이어, 우리는 동시에 상대적으로 매우 쉽고을 사용하여 24 명에서 11 유전자 (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 및 TP53)를 분석 할 수있는 프로토콜을 개발하기로 결정 매체 처리 장치 및 농축 transposase 시퀀싱 기술을 기반으로 빠른 프로토콜. 감사합니다이 기술로, 우리는 2500 염기쌍의 인트론 영역이 포함되지 않은 RAP80, (: 176,381,588-176,390,180 CHR5)을 제외하고, 3'-UTR의 단부에 프로모터 개시로부터 완전한 유전자 서열. 이는 2734 프로브 연구에 대한 1,000,300 염기쌍의 합계를 나타냅니다. 일반적으로 BRCA1과 BRCA2 엑손 서열은 20 명 미만 환자의 1.5 개월을 필요로 생거 시퀀싱에 의해 분석된다. 본 프로토콜 (도 1)와 동일한 시간에, 75 개 이상 11 명의 환자에 대한 완전한 유전자를 분석 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
NGS 장치 및 기술의 광범위한 사용은 암과 유전 질환의 연구에 새로운 기회를 제공하고 있습니다. 전체 게놈 염기 서열 또는 RNA 서열에 더하여, 다수의 환자에서 선택된 서열의 gDNA를 다량의 분석을 동시에 진단에 큰 가능성을 제공한다. 여기에, 우리는 중간 서열 분석 장치 (자재 / 장비의 표)와 동시에 24 명에서 11 완전한 유전자를 연구하는 Nextera 기술을 사용하여 (필요시) 특정 디자인을 개발했다…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Ligue contre le Cancer de Côte d’Or and the Centre Georges-François Leclerc for their financial support. We thank Philip Bastable for the editing of the manuscript.
Materials
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software |
|
| Illumina | Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new> Manufacturer website tool |
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