Summary

gDNA berikelse av en Transposase-basert teknologi for NGS Analyse av hele sekvensen av<em> BRCA1</em>,<em> BRCA2</em>, og ni gener involvert i DNA Damage Repair

Published: October 06, 2014
doi:

Summary

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

Abstract

Den utbredte bruken av Next Generation Sequencing har åpnet nye veier for kreftforskning og diagnostikk. NGS vil bringe store mengder nye data om kreft, og spesielt kreft genetikk. Dagens kunnskap og fremtidige funn vil gjøre det nødvendig å studere et stort antall gener som kan være involvert i en genetisk predisposisjon for kreft. I denne forbindelse har vi utviklet en Nextera design for å studere 11 komplette gener involvert i DNA-skade reparasjon. Denne protokollen ble utviklet for å trygt studere 11 gener (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, og TP53) fra arrangøren til 3'-UTR hos 24 pasienter samtidig. Denne protokollen, basert på transposase teknologi og gDNA berikelse, gir en stor fordel i form av tid for genetisk diagnostikk takket være prøve multipleksing. Denne protokollen kan trygt brukes med blod gDNA.

Introduction

I 2010, nesten 1,5 millioner mennesker (hovedsakelig kvinner) utviklet brystkreft på verdensbasis. Det er anslått at 5 til 10% av tilfellene var arvelig. Nesten 20 år siden, ble BRCA1 og BRCA2 identifisert som involvert i arvelig bryst-og eggstokkreft en. Siden ca 15 år siden, har BRCA1 og BRCA2 koding regioner blitt sekvensert å bestemme genetisk predisposisjon for bryst og eggstokk kreft. Endringer i BRCA1 og BRCA2 er påvist i 10 til 20% av utvalgte 세스 familier antyder at analysen av disse regionene ikke er tilstrekkelig for effektiv filtrering. Nylig, analyse av ikke-kodende sekvenser (Arrangøren, introner, 3-'UTR) av BRCA1 og BRCA2 fremhevet at nye mutasjoner / varianter kan være knyttet til en høyere risiko for brystkreft 3-6.

BRCA1 og BRCA2 proteiner er involvert i homolog rekombinasjon Repair (HHR), som er utført av mange partnere 7. Mens endringer i BRCA1 eller BRCA2 indusere defekter i DNA-reparasjon, kan de andre partnerne også påvirke risikoen for brystkreft. Denne hypotesen synes å ha blitt validert siden BRIP1 8 og PALB2 9 har en bevist effekt på livmorhals og brystkreft, henholdsvis. I tillegg kan to andre "moderat risiko" brystkreftresistensgener, minibank og CHEK2, også bli undersøkt rutinemessig 10.

Etter på fra disse studiene, har vi besluttet å utvikle en protokoll for å analysere 11 gener (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80, og TP53) i 24 pasienter samtidig ved hjelp av en veldig enkel og relativt fort protokoll basert på transposase-teknologi, med anrikning og sekvensering på et medium gjennomstrømning enhet. Takktil denne teknikk, har vi sekvensert fullstendige gener fra starten av promoteren til enden av 3'-UTR, bortsett RAP80, hvor en intronic regionen i 2500 bp ble ikke dekket (Chr5: 176,381,588-176,390,180). Dette representerer totalt ca 1.000.300 bp studert med 2734 sonder. Vanligvis er BRCA1 og BRCA2 exonic sekvenser analysert ved Sanger-sekvensering, som trenger 1,5 måneder for mindre enn 20 pasienter. Med den foreliggende protokoll (figur 1), på samme tid, 11 komplette gener for mer enn 75 pasienter kunne bli analysert.

Protocol

1. Vurdering av gDNA (genomisk DNA) Yield Kvantifisere nylig hentet gDNA før utarbeidelse av biblioteket. Bruk fluorometrisk avkastning vurderings metode for å kvantifisere intakt gDNA (unngå å bruke et spektrofotometer for gDNA avkastning vurdering). Mål (260/280 nm) ratio, og sikre at det er mellom 1,8 og 2. MERK: 50 ng av gDNA er nødvendig for forsøket. 2. gDNA Enrichment: Dag 1, Morgen Før start Fra DNA berikelse kit (se tabell av materiell / …

Representative Results

Eksempel QC Resultater Evnen av denne metode for å bestemme sekvenser av målgener er basert på kvaliteten av gDNA (figur 2A), og kvaliteten av tagmentation trinn. Hvis tagmentation ikke er tilstrekkelig (figur 2B, øvre panel), vil sekvense ikke være tilfredsstillende. Som nevnt ovenfor, etter at tagmentation rensing, den gDNA bør tagmented til fragmenter fra 150 bp til 1000 bp med flertallet av fragmenter rundt 300 bp (figur 2B, nedre pan…

Discussion

Den utbredte bruken av NGS enheter og teknologier har gitt nye muligheter i studiet av kreft og genetiske lidelser. I tillegg til hele genomet sekvensering eller RNA-sekvensering, gir analysen av en stor mengde av utvalgte gDNA sekvenser i en rekke pasienter som samtidig gode utsikter i diagnose. Her har vi utviklet en bestemt design (tilgjengelig på forespørsel) bruker Nextera teknologi for å studere 11 komplette gener hos 24 pasienter samtidig med et medium throughput sekvense enhet (Table of Materials / utstyr). D…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the Ligue contre le Cancer de Côte d’Or and the Centre Georges-François Leclerc for their financial support. We thank Philip Bastable for the editing of the manuscript.

Materials

MiSeq Illumina SY-410-1001 Sequencing/medium throughput device
Nextera Enrichment kit Illumina FC-123-1208 Transposase based technology
300 cycle cartridge Illumina 15033624
AMPure beads Beckman Coulter A63881 Magnetic purification beads
Magnetic stand Alpaqua A32782
96-well plates Life Technologies 4306737
MIDI 96-well plates Biorad AB0859
Microseal A Biorad MSA-5001 This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment
MiSeq Illumina Provided with the sequencing device
Experiment Manager software
Illumina Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new>
Manufacturer website tool

References

  1. Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
  2. Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
  3. Cox, D. G., et al. Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers. Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).
  4. Maia, A. T., et al. Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res. 14 (2), 63 (2012).
  5. Anczuków, O., et al. BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy. Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).
  6. Brewster, B. L., et al. Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3’UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site. Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).
  7. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).
  8. Ma, X. D., et al. First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer. Gene. 524 (2), 208-213 (2013).
  9. Haanpää, M., Pylkäs, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families. BMC Med. Genet. 14, 82 (2013).
  10. Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation. Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).
  11. Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice. Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).
  12. Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing. J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).
  13. Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing. Plos One. 6, e28240 (2011).
  14. de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing. Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).
  15. . The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers. J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).
  16. Levy-Lahad, E., Friedman, E. Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).
  17. Risch, H. A., et al. Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada. J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).
  18. Slater, E. P., et al. PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families. Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).
  19. Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W. BRCA and pancreatic cancer. J.O.P. 14 (4), 325-328 (2013).
check_url/kr/51902?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Chevrier, S., Boidot, R. gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair. J. Vis. Exp. (92), e51902, doi:10.3791/51902 (2014).

View Video