Method Article

의 전체 순서의 NGS 분석을위한 Transposase 기반 기술에 의해 gDNA를 농축 BRCA1 BRCA2, 9 유전자

DOI:

10.3791/51902

⸱

October 6th, 2014

 , 
1Department of Biology and Pathology of Tumors, Unit of Molecular Biology, Platform of Immunomonitoring and Genetics, Centre Georges-François Leclerc

In This Article

Summary

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NGS 염기서열분석을 위한

gDNA 농축은 체질적 돌연변이 연구를 위한 쉽고 강력한 도구입니다. 이 기사에서는 DNA 손상 복구에 관여하는 11개 유전자의 전체 염기서열을 간단히 분석하는 절차를 제시합니다.

Abstract

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차세대 시퀀싱의 광범위한 사용은 암 연구 및 진단을위한 새로운 길을 열었습니다. NGS는 거대한 암에 대한 새로운 데이터의 양, 특히 암 유전학을 가져올 것이다. 현재의 지식과 미래의 발견은 필요한 암의 유전 적 소인에 관여 할 수있는 유전자의 거대한 숫자를 연구 할 것입니다. 이러한 관점에서, 우리는 DNA 손상의 복구에 관여하는 유전자의 완전한 11 공부 Nextera 설계를 개발 하였다. 이 프로토콜은 안전하게 동시에 24 명에서 11 유전자 (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 및 TP53) 프로모터에서 3'-UTR을 연구하기 위해 개발되었다. transposase 기술과 gDNA를 농축에 따라이 프로토콜은, 다중화를 샘플링 할 수있는 유전자 진단 덕분에 시간의 측면에서 큰 장점을 제공합니다. 이 프로토콜은 혈액 gDNA를 안전하게 사용할 수있다.

Introduction

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2010 년 (기본적으로 여성) 거의 1백50만명는 전 세계적으로 유방암을 개발했다. 그러나, 이들의 경우 5-10 %의 유전 있다고 추정된다. 유전성 유방암과 난소 암의 1에 관련된 거의 이십년 전, BRCA1과 BRCA2가 확인되었다. 약 15 년 전 이후로, BRCA1 및 BRCA2 코딩 영역은 유방암과 난소 암에 대한 유전 적 소인을 결정하는 순서가되었다. BRCA1 및 BRCA2의 변화는 이들 영역의 분석을 효과적으로 스크리닝 충분하지 않은 것을 시사 선택된 가족이 10-20 %가 검출된다. 최근, BRCA1 및 BRCA2의 비 - 코딩 서열 (프로모터, 인트론, 3 'UTR)의 분석은 새로운 돌연변이 / 변형 유방암 3-6의 높은 위험에 링크 될 수 있다는 것을 강조 하였다.

BRCA1과 BRCA2 단백질은 (상동 재조합 수리에 참여하고 있습니다수많은 파트너 (7)에 의해 완료 HHR). BRCA1 또는 BRCA2의 변화는 DNA 복구에 결함을 유발하지만, 다른 파트너는 유방암 위험에 영향을 미칠 수있다. 이 가설은 BRIP1....

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Protocol

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gDNA를 1. 평가 (게놈 DNA) 수익률

  1. 갓 라이브러리의 준비를하기 전에 gDNA를 추출 정량화. (gDNA를 수익률 평가를위한 분광 광도계를 사용하지 마십시오) 그대로 gDNA를 정량화하기 위해 형광 수율의 평가 방법을 사용합니다. (280 분의 260 nm의) 비율을 측정하고 주 1.8 사이 2가 있는지 확인 : gDNA를 50 ng의 실험이 필요합니다.

2 gDNA를 보충 : 1 일, 아침

  1. 시작하기 전에
    1. DNA 농축 키트에서 DNA 버퍼 (TD) 및 얼음에 DNA 효소 (TDE1) 솔루션 해동 (자재 / 장비의 표 참조). 적어도 30 분 사용하기 전에, 정화 자석 구슬을 가져다 목표 명세서 (ST)를 중지 실온 (RT)에 버퍼. 샘플 당 잘 μL 직접 96 웰 플레이트에 / 2-2.5 NG에 일을 gDNA를 샘플의 20 μl를 추가합니다. 중요 : 프로토콜 (알려진 서열 변이 샘플)을 확인하는 긍정적 인 컨트롤을 사용합니다.
  2. Tagmentation
    1. MIX 모두 철저하게 배를 반전하여 시약 및 스핀 다운 잠시. RT에서 TDE1 버퍼의 각 웰 gDNA를 50 NG (20 μL)를 포함하고 5 μL에 TD 버퍼의 2....

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Results

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샘플 QC 결과

표적 유전자의 서열을 결정하는 본 방법의 기능은 gDNA를 (도 2a)의 품질 및 tagmentation 단계의 품질에 기초한다. tagmentation은 (도 2b를 참조하면, 상부 패널) 충분하지 않은 경우, 시퀀스는 만족스럽지 않을 것이다. 전술 한 바와 같이, tagmentation 정제 후, gDNA를 약 300 bp의 단편의 대부분 (도 2B, 하부 패널)로 1000 염기쌍 150로부터 염기쌍 조각으로 tagmented한다.

라이브러리 제제의 끝에서, 라이브러리 품질 Bioanalyser을 사용하여 판정한다. 얻어진 프로파일 tagmentation 후 그러나 단편 높은 숫자 (도 2C)와 대략 동일해야한다. 라이브러리 품질 1C 그림과 동일하지 않은 경우.......

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Discussion

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NGS 장치 및 기술의 광범위한 사용은 암과 유전 질환의 연구에 새로운 기회를 제공하고 있습니다. 전체 게놈 염기 서열 또는 RNA 서열에 더하여, 다수의 환자에서 선택된 서열의 gDNA를 다량의 분석을 동시에 진단에 큰 가능성을 제공한다. 여기에, 우리는 중간 서열 분석 장치 (자재 / 장비의 표)와 동시에 24 명에서 11 완전한 유전자를 연구하는 Nextera 기술을 사용하여 (필요시) 특정 디자인을 개발했다. 이 프로토콜은 오류의 위험이 낮은 환자의 관심사에 대한 신속한 대응을 가능하게 데이터를 신속하게 생성 할 수 있습니다. 도 6에 도시 된 바와 같이, 생거 시퀀싱 검출 모든 유전 적 변이는 또한 transposase 기반 제조 키트를 사용하여 검출 하였다. 이 방법은 특히 직접 분석 복잡한 INDEL의 변화에​​ 대해, 신뢰성과 쉽게 해석 할 수있다. 그럼에도 불구하고, 중요하다마이너스 가닥에있는 유전자,이 뉴클레오티드 (반전)없이 보완 할 필요가 있습니다입니다. 본 연구는 11 전체.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

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우리는 Ligue contre le Cancer de Côte d'Or와 Centre Georges-François Leclerc의 재정적 지원에 감사드립니다. 원고를 편집해 준 필립 바스터블(Philip Bastable)에게 감사한다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MiSeqIlluminaSY-410-1001염기서열분석/중간 처리량 장치
Nextera Enrichment kitIlluminaFC-123-1208트랜스포사제 기반 기술
300 사이클 카트리지Illumina15033624
AMPure 비드Beckman CoulterA63881자기 정제 구슬
마그네틱 스탠드AlpaquaA32782
96웰 플레이트Life Technologies4306737
MIDI 96웰 플레이트BioradAB0859
Microseal ABioradMSA-5001이 씰은 PCR 증폭에만 필요합니다. 실험 전반에 걸쳐 다른 표준 씰을 사용할 수 있습니다
MiSeqIllumina염기서열분석 장치와 함께 제공됨
Experiment Manager 소프트웨어
인터넷 주소: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new
제조업체 웹 사이트 도구

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
  2. Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).

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Transposase TechnologygDNA EnrichmentBRCA1 BRCA2 AnalysisDNA Damage RepairNext Generation SequencingHybridization CapturePCR AmplificationMagnetic Bead PurificationFragment AnalyzerBioinformatics Analysis

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