gDNA Anrikning av ett transposas baserad teknik för NGS Analys av hela sekvensen av<em> BRCA1</em>,<em> BRCA2</em>, och nio gener involverade i DNA-skador Repair
Summary
gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.
Abstract
Den utbredda användningen av nästa generations sekvensering har öppnat nya vägar för cancerforskning och diagnos. NGS kommer att ge enorma mängder nya data om cancer, och särskilt cancergenetik. Nuvarande kunskap och framtida upptäckter kommer att göra det nödvändigt att studera ett stort antal gener som kan vara inblandade i en genetisk predisposition för cancer. I detta avseende har vi utvecklat ett NextEra design för att studera 11 kompletta gener involverade i DNA-skador reparation. Detta protokoll har utvecklats för att på ett säkert sätt studera 11 gener (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 och TP53) från promotor till 3'-UTR i 24 patienter samtidigt. Detta protokoll, som bygger på transposas teknik och gDNA anrikning, ger en stor fördel när det gäller tiden för genetisk diagnostik tack till prov multiplexering. Detta protokoll kan användas säkert med blod gDNA.
Introduction
Under 2010 nästan 1,5 miljoner människor (främst kvinnor) utvecklade bröstcancer över hela världen. Man uppskattar att 5 till 10% av dessa fall var ärftlig. Nästan 20 år sedan, var BRCA1 och BRCA2 identifierats som inblandade i ärftlig bröst-och äggstockscancer 1. Sedan cirka 15 år sedan, har BRCA1 och BRCA2 kodande regioner sekvenserats för att fastställa den genetiska anlag för bröstcancer och äggstockscancer. Förändringar i BRCA1 och BRCA2 påvisas i 10 till 20% av utvalda familjer 2 tyder på att analysen av dessa regioner inte är tillräckligt för effektiv screening. Nyligen analys av icke-kodande sekvenser (promotor, introner, 3-'UTR) av BRCA1 och BRCA2 betonat att nya mutationer / varianter kunde kopplas till en högre risk för bröstcancer 3-6.
BRCA1 och BRCA2-proteiner är inblandade i homolog rekombination Repair (HHR), vilket kompletteras med ett flertal partners 7. Även förändringar i BRCA1 eller BRCA2 inducerar defekter i DNA-reparation kan övriga parter också påverkar risken för bröstcancer. Denna hypotes verkar ha validerats sedan BRIP1 8 och PALB2 9 har en bevisad effekt på livmoderhalscancer och bröstcancer, respektive. Dessutom kan två andra "måttlig risk" bröstcancerresistensgener, ATM och CHEK2, också studeras rutinmässigt 10.
Uppföljning av dessa studier, beslutade vi att ta fram ett protokoll för att analysera 11 gener (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80 och TP53) hos 24 patienter samtidigt med hjälp av en mycket enkel och relativt snabb protokoll baserat på transposase teknik, med anrikning och sekvensering på ett medium genomströmning enhet. Tackdenna teknik, sekvens vi kompletta gener från början av promotorn till slutet av 3'-UTR, utom RAP80, för vilken en intronregion 2500 bp inte omfattades (Chr5: 176,381,588-176,390,180). Detta motsvarar totalt cirka 1.000.300 bp studeras med 2734 sonder. Vanligtvis är BRCA1 och BRCA2 exonic sekvenser analyseras av Sanger-sekvensering, som behöver 1,5 månader för mindre än 20 patienter. Med det nuvarande protokollet (Figur 1), på samma tid, 11 kompletta gener för mer än 75 patienter kunde analyseras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den utbredda användningen av NGS-enheter och tekniker har gett nya möjligheter i studiet av cancer och genetiska sjukdomar. Förutom hela genom sekvensering eller RNA-sekvensering, analys av en stor mängd utvalda gDNA sekvenser i många patienter ger samtidigt stora möjligheter i diagnos. Här utvecklade vi en specifik design (tillgänglig på begäran) med NextEra teknik för att studera 11 kompletta gener hos 24 patienter samtidigt med ett medium genomströmning sekvenseanordning (Table of Materials / utrustning)….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Ligue contre le Cancer de Côte d’Or and the Centre Georges-François Leclerc for their financial support. We thank Philip Bastable for the editing of the manuscript.
Materials
| MiSeq | Illumina | SY-410-1001 | Sequencing/medium throughput device |
| Nextera Enrichment kit | Illumina | FC-123-1208 | Transposase based technology |
| 300 cycle cartridge | Illumina | 15033624 | |
| AMPure beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic purification beads |
| Magnetic stand | Alpaqua | A32782 | |
| 96-well plates | Life Technologies | 4306737 | |
| MIDI 96-well plates | Biorad | AB0859 | |
| Microseal A | Biorad | MSA-5001 | This seal is necessary only for PCR amplification. Other standard seals can be used throughout the experiment |
| MiSeq | Illumina | Provided with the sequencing device Experiment Manager software |
|
| Illumina | Internet adress: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new> Manufacturer website tool |
References
- Cornelisse, C. J., Cornelis, R. S., Devilee, P. Genes responsible for familial breast cancer. Pathol. Res. Pract. 192 (7), 684-693 (1996).
- Culver, J., Lowstuter, K., Bowling, L. Assessing breast cancer risk and BRCA1/2 carrier probability. Breast Dis. 27, 5-20 (2007).
- Cox, D. G., et al. Common variants of the BRCA1 wild-type allele modify the risk of breast cancer in BRCA1 mutation carriers. Hum. Mol. Genet. 20 (23), 4732-4747 (2011).
- Maia, A. T., et al. Effects of BRCA2 cis-regulation in normal breast and cancer risk amongst BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res. 14 (2), 63 (2012).
- Anczuków, O., et al. BRCA2 deep intronic mutation causing activation of a cryptic exon: opening toward a new preventive therapeutic strategy. Clin. Cancer Res. 18 (18), 4903-4909 (2012).
- Brewster, B. L., et al. Identification of fifteen novel germline variants in the BRCA1 3’UTR reveals a variant in a breast cancer case that introduces a functional miR-103 target site. Hum. Mutat. 33 (12), 1665-1675 (2012).
- Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nat Rev Cancer. 12 (1), 68-78 (2012).
- Ma, X. D., et al. First evidence for the contribution of the genetic variations of BRCA1-interacting protein 1 (BRIP1) to the genetic susceptibility of cervical cancer. Gene. 524 (2), 208-213 (2013).
- Haanpää, M., Pylkäs, K., Moilanen, J. S., Winqvist, R. Evaluation of the need for routine clinical testing of PALB2 c.1592delT mutation in BRCA negative Northern Finnish breast cancer families. BMC Med. Genet. 14, 82 (2013).
- Southey, M. C., Teo, Z. L., Winship, I. PALB2 and breast cancer: ready for clinical translation. Appl. Clin. Genet. 6, 43-52 (2013).
- Ulahannan, D., Kovac, M. B., Mulholland, P. J., Cazier, J. B., Tomlinson, I. Technical and implementation issues in using next-generation sequencing of cancers in clinical practice. Br. J. Cancer. 109, 827-835 (2013).
- Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing. J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).
- Knierim, E., Lucke, B., Schwarz, J. M., Schuelke, M., Seelow, D. Systematic comparison of three methods for fragmentation of long-range PCR products for next generation sequencing. Plos One. 6, e28240 (2011).
- de Sousa Dias, M., Hernan, I., Pascual, B., Borràs, E., Mañé, B., Gamundi, M. J., Carballo, M. Detection of novel mutations that cause autosomal dominant retinitis pigmentosa in candidate genes by long-range PCR amplification and next-generation sequencing. Mol. Vis. 19, 654-664 (2013).
- . The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers. J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).
- Levy-Lahad, E., Friedman, E. Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers. Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).
- Risch, H. A., et al. Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada. J. Natl. Cancer Inst. 98 (23), 1694-1706 (2006).
- Slater, E. P., et al. PALB2 mutations in European familial pancreatic cancer families. Clin. Genet. 78, 490-494 (2010).
- Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W. BRCA and pancreatic cancer. J.O.P. 14 (4), 325-328 (2013).
