Régénération rénale à l'âge adulte poisson zèbre par gentamicine blessures induites
Summary
Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.
Abstract
The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.
Introduction
Le rein est essentiel pour l'homéostasie du fluide, la régulation de la pression artérielle et la filtration des déchets de l'organisme. Bien que les mammifères sont capables de réparer néphrons existantes après une blessure en utilisant des cellules épithéliales différenciées 1-4, ils semblent manquer d'un pool de cellules souches réservés 5 et sont incapables de former de nouveaux néphrons de novo. Contrairement aux mammifères, les poissons adultes sont capables de former de nouveaux néphrons long de la vie adulte pour soutenir la croissance des poissons et en réponse à une blessure 6,7. Le poisson zèbre, Danio rerio, est un organisme modèle inestimable pour l'étude de la régénération d'organes 8-10 et a le potentiel de fournir un aperçu puissants dans les applications pour l'ingénierie de la réparation des reins humains. La Tg (Lhx1a: EGFP) 11 transgène a été montré pour étiqueter un pool de cellules progénitrices néphron dans le rein adulte de poisson zèbre 12, cependant mécanismes contrôlant la réponse des cellules à lhx1a + r blessureEmain claire.
La gentamicine est un antibiotique aminoglycoside largement utilisé avec des effets néphrotoxiques et ototoxiques connus chez l'homme 13. L'injection intrapéritonéale de la gentamicine est une méthode établie d'induire lésion rénale aiguë chez les poissons 6. Cette blessure dans les synoptiques de poissons de la perte de l'épithélium tubulaire et la cicatrisation des glomérules qui se produit chez l'homme après la gentamicine 14 surdosage. Induire des blessures chez le poisson zèbre par injection de gentamicine est un moyen pratique d'induire une réponse forte de régénération, synchrone, avec de nombreux nouveaux produits et néphrons procéder simultanément à travers les étapes de la formation, de la prolifération et de la différenciation.
Ce protocole détaille notre méthode de blessure robuste et reproductible chez l'adulte poisson zèbre rein en utilisant un processus visuel non invasif de dépistage pour réduire au minimum les valeurs aberrantes. Nous profitons du fait que des blessures avec la gentamicine conduit à la mort du tissu rénal épithéliale et le formation de moulages tubulaires rénales, qui accumulent alors en masses dans les conduits et mésonéphriques cloaque. Ceux-ci sont transmises par les poissons et peuvent être observés visuellement dans l'eau. Cela nous permet de l'écran pour le poisson avec une forte blessure non mortelle, qui peut ensuite être mis en commun pour plus d'expérimentation. Minimiser le nombre de poissons indemne ou poissons qui meurent avant d'atteindre le critère d'évaluation de l'expérience conduit à plus uniforme et la collecte de données et une analyse efficaces. En outre, aucun des dispositifs spéciaux ou de réactifs sont nécessaires, ce qui rend cette méthode rentable et appropriée pour une utilisation dans un cadre universitaire ou de l'enseignement. Grâce à notre méthode, nous montrons ici les effets croissants de dose de gentamicine sur régénération rénale ainsi que l'effet de l'augmentation de la température.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le poisson zèbre est idéal pour étudier la régénération des organes adultes, y compris l'adulte rénale mésonéphrique 6. Des études récentes ont profité de marqueurs moléculaires et de nouvelles lignes rapporteurs transgénique afin de mieux caractériser les étapes qui se produisent pendant néphrons régénération et ce que les cellules pourraient être responsables 7,12. Observation des cylindres urinaires a été utilisé pendant plus d'un siècle pour diagnostiquer les ma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant F32DK091998 to CNK; NIH grant RO1DK041071 and Harvard Stem Cell Institute grant D001229 to IAD. The authors thank Neil Hukriede for the lhx1ain situ probe.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| gentamicin sodium sulfate | Sigma | G1264 | TOXIC, purity varies from batch to batch |
| plastic transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | |
| 1 ml Norm-Ject syringes | Electron Microscopy Sciences | 72520 | green plastic syringes, ordinary 1ml syringes are OK, but harder to read accurately |
| 30G1/2 needles | Becton Dickinson | 305106 | |
| ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine) | Sigma | A5040 | IRRITANT |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make 4% in 1xPBS for working solution |
References
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